茉莉酸甲酯对Botryosphaeria dothidea的抑菌作用及其代谢酶活性的影响

发布时间：2020-09-03 18:20

　　近年来贵州省猕猴桃产业呈喷井式发展,已成为贵州省重要的扶贫产业。猕猴桃软腐病是猕猴桃果实贮藏期的重要病害,其主要致病菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。目前针对猕猴桃软腐病的防治主要以化学防治为主,化学农药虽可有效控制猕猴桃软腐病的发生,但存在耐药性、抗性、环境污染及农药残留等诸多问题。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)作为高等植物体内广泛存在的内源调节激素,在植物生长发育和次生代谢方面发挥着极为重要的作用,目前已有人利用MeJA直接抑制植物病原真菌,且达到较理想的效果,但MeJA对猕猴桃软腐病菌B.dothidea的抑菌活性及作用机制尚未见相关研究,阻碍了MeJA作为抑制剂的开发和实际应用。鉴于此,本研究通过测定MeJA对猕猴桃软腐病菌B.dothidea的抑菌作用,并进一步研究MeJA对B.dothidea菌丝形态、超微结构、呼吸代谢及酶活性、细胞膜结构及遗传物质的影响,开展了MeJA对猕猴桃软腐病菌的防治及果实品质的影响,为MeJA在猕猴桃上的应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.采用组织分离法对猕猴桃病果进行分离,以柯赫氏法则测定致病性,获得一株致病力较高的菌株。通过形态学及分子生物学rDNA-ITS序列测定,该菌株与B.dothidea同源性达100%。因此,确定本试验分离所获得的猕猴桃软腐病的致病菌株为B.dothidea。2.采用菌丝生长速率法、称重法、孢子萌发法测定不同浓度MeJA对B.dothidea菌丝生长、菌丝生长量及孢子萌发的影响。结果显示,MeJA对猕猴桃软腐病菌B.dothidea菌丝生长有抑制作用,EC_(50)为0.2327 mmol/L;0.80 mmol/L MeJA对B.dothidea菌丝生长量抑制率达86.51%;同时MeJA对B.dothidea孢子萌发的具有抑制作用,浓度为0.80 mmol/L时抑制率达83.74%。通过扫面电镜及透射电镜观察,0.80 mmol/L MeJA处理B.dothidea菌丝后,可导致菌丝细胞细胞壁溶解、细胞核及线粒体增多且形状变得不规则、细胞内空腔增加,从而破坏B.dothidea菌丝细胞结构达到杀死病原菌的作用。3.利用碘乙酸、丙二酸和磷酸钠三种真菌典型呼吸抑制剂同MeJA进行叠加使用,通过MeJA与呼吸抑制剂叠加率来判断MeJA抑制病原真菌的呼吸途径,并测定MeJA处理后呼吸代谢酶活性。结果表明,MeJA和丙二酸叠加使用,叠加率最低,认为MeJA通过三羧酸循环抑制猕猴桃软腐病原菌呼吸代谢;而MeJA与碘乙酸叠加率较高,提示糖酵解途径可能也受到MeJA的影响;MeJA处理对细胞代谢过程中ATP能量消耗与合成、代谢酶活琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的产生均有影响,MeJA抑制琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活性,干扰三羧酸循环,抑制ATP的合成,进而导致线粒体内ATP衰竭,达到杀死病原菌的效果。4.通过电导法、紫外分光光度法测定菌丝培养液电导率、蛋白质及核酸相对泄漏度;采用考马斯亮蓝法、CTAB法测定MeJA对B.dothidea蛋白质及DNA含量,探究MeJA处理B.dothidea对菌丝细胞膜功能及遗传物质的影响。结果显示,MeJA处理可引起菌丝细胞膜相对电导率、蛋白质与核酸相对泄漏度升高,随着时间延长,作用效果越明显;且MeJA处理B.dothidea后菌丝细胞壁β-1,3-葡聚糖酶活性增强,细胞壁几丁质主要组分N-乙酰氨基葡萄糖含量升高;MeJA处理后B.dothidea体内蛋白质、DNA含量明显降低,可能直接抑制或干扰病原菌DNA及蛋白质的合成。5.为明确MeJA对猕猴桃软腐病田间防效及果实品质的影响,在猕猴桃不同生长期利用MeJA进行处理。田间试验结果显示:采前一个月用0.5 mmol/L MeJA浸果对猕猴桃软腐病控制效果较好,防效达到77.70%;且MeJA处理可有效改善果实外观品质,提高果实维生素C、可溶性固形物含量,MeJA处理可提高果实硬度,明显延缓果实可溶性固形物、可溶性糖含量的上升速率,降低维生素C的损失率,从而达到改善猕猴桃果实贮藏性能。本研究表明,MeJA处理可以直接抑制B.dothidea的生长,破坏菌丝细胞功能及结构,抑制DNA和蛋白质的合成,0.5 mmol/L MeJA对田间猕猴桃软腐病防效达到77.70%,且能提高猕猴桃果实品质,改善贮藏性能。研究结果可为MeJA在猕猴桃上的应用提供理论参考。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.634.1
【部分图文】：

病原菌,菌株,培养基,软腐病

有 0.00（CK）、0.8 mmol/L MeJA 的 PDA 培养基上取直径为 5 mm 的菌饼，用 2.5%戊二醛，磷酸缓冲4℃），1%锇酸固定液固定 2-3 h。乙醇梯度脱水，埋处理。3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色法染色后，对切。每个样品至少观察 10 份超薄切片。析定将分离纯化的菌株回接到健康猕猴桃果实上，结果发病，且发病症状与田间自然发病症状相同，依次实上病斑进行再分离得到的菌株在 PDA 培养基上的表明所分离得到的病原菌是猕猴桃软腐病的病原菌，致病性相对较强，作为后续研究菌株。

孢子形态,菌丝形态,病原菌

州大学 2019 硕士论文茉莉酸甲酯对 Botryosphaeria dothidea 的抑菌作用及其代谢酶活性的影2 病原菌形态特征RF-2 菌落初期白色，棉絮状，培养 3~4 d 后，菌落中央逐渐转为墨绿色散，后再转为黑色，边缘不整齐，经 72 h 生长菌落直径达 70 mmA/B），分生孢子无色，无隔膜，壁薄，外壁光滑，长椭圆形，平均宽 5.88 (4) μm，平均长度 19.59(17.86～21.43) μm (图 2.2-C)。A B C

菌丝形态,DNA琼脂糖凝胶电泳,菌株,葡萄座腔菌

2.2 RF-2 病原菌菌丝形态及孢logy of mycelia and spores of RF/ITS5对菌株RF-2进行 PCR的片段长度分别为 523 bp对，菌株 RF-2 与葡萄座腔菌.1、KF 293916.1）同源性达于同一分支，进化距离最近为 B. dothidea（图 2.4）。

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