荷兰进口百合中车前草花叶病毒的鉴定及分子特征研究

发布时间：2020-09-15 13:42

　　百合是世界上集观赏、食用为一体的重要园艺作物,植物学分类上属于百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)。为满足对百合的巨大需求,中国主要从荷兰引进了大量的百合鳞茎繁殖材料。带毒鳞茎的引进致使百合病毒在中国传播、蔓延。病毒是百合产量提升的重要限制因素。在中国,百合上的病毒主要有百合斑驳病毒(Lilymottlevirus,LMoV)、百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)。最近,一种新的感染百合的车前草花叶病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus,PlAMV)被鉴定,该病毒属于甲型线形病毒科(Alphafilexiviridae)马铃薯X病毒属(Potexvirus),在美国、匈牙利、荷兰、哥斯达黎加、智利、西班牙、英国、意大利、日本、韩国、俄国和中国均有报道。本研究的主要目的是通过高通量测序(Nextgeneration sequencing,NGS)鉴定百合植物中PlAMV,分析其分子特性,利用RT-PCR和RT-qPCR进行验证。首先,建立3个百合样品的混合池进行高通量测序。测得reads序列用Trinity软件拼接成较长的contig片段,使用NCBI在线分析工具BLASTN进行contig序列的比对分析。基于序列比对结果,设计2对引物扩增百合样品中PlAMV的全基因组序列。同时,从北京、云南和辽宁采集百合样品共计40份,提取总RNA,RT-PCR和RT-qPCR方法检测PlAMV的侵染情况,统计发生率。对PCR产物进行克隆测序,使用MEGA6软件构建系统发育树。NGS测序拼接后获得一个长度为6174 nt的contig,与GenBank数据中的登陆的PlAMV分离物序列一致性为78%to 99%。之后,以RT-PCR结合5'和3'RACE方法从百合‘Siberia’中获得PlAMV的全长基因组,该PlAMV-Siberia分离物全长6101 nt。与Potexvirus相似,PlAMV-Siberia包含5个开放阅读框,分别编码156 kDa(ORF1)、25 kDa(ORF2)、12 kDa(ORF3)、13 kDa(ORF4)和12 kDa(ORF5)大小的蛋白。PlAMV-Siberia全基因组与GenBank数据中的登陆的PlAMV分离物核酸序列一致性为78%to 99%,编码区氨基酸序列一致性为49-99%。研究构建了基于ORF1(RdRP)和OFR5(CP)的系统发育树,表明PlAMV-Siberia与PlAMV-Concador分离物关系较近。基于Potexviruses病毒属全基因组的进化发育分析结果表明,PlAMV-Siberia与郁金`香X病毒(Tulip virus X,TVX)聚在一起。最后,本研究设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了一步RT-qPCR检测体系,用于快速诊断百合样品中的PlAMV。对已知浓度的总RNA,进行10倍浓度梯度稀释,即从10~(10)到10~1,制作了RT-qPCR的定量标准曲线。研究比较了传统RT-PCR和一步RT-qPCR方法对百合样品中PlAMV的检测特异性、灵敏性和适用性,发现两种检测方法结果基本一致。使用RT-qPCR检测了来自于北京的40个百合样品,仅5个样品显示PlAMV阳性,检出率为12.5%。相较于传统RT-PCR方法,RT-qPCR操作简单、快速、可靠性高,能够用于对百合中PlAMV的常规检测。本研究首次建立了百合样品中PlAMV的TaqMan探针一步RT-qPCR检测方法。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.8

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