柑橘黄化脉明病毒的遗传多样性及种群变异研究

发布时间：2020-09-16 07:59

　　柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),隶属于甲型线状病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒属Mandarivirus,该病毒主要侵染柠檬、甜橙、酸橙、葡萄柚等常见柑橘寄主。自2014年我国首次报道该病毒发生以来,由CYVCV引起的柑橘黄化脉明病已在多个地区爆发成灾,病害发生呈上升的趋势。明确我国CYVCV的遗传变异情况,可为了解CYVCV致病性及其流行发生规律提供更好的依据,对于制定CYVCV的有效防控措施,防止CYVCV在我国大发生具有重要意义。本研究从四川、湖北、广西和云南4个省份共采集了86份疑似柑橘黄化脉明病样品,利用CYVCV特异性引物对其进行了RT-PCR检测。结果表明,在86份CYVCV田间疑似样品中有56份样品均检测到CYVCV,总检出率为65.12%。统计不同寄主样品中CYVCV的检出率发现,在柠檬样品中CYVCV的检出率最高,达83.33%;柚子中CYVCV的检出率最低,为16.67%。对不同地理来源的样品检出情况进行分析发现,各地区样品中CYVCV的检出率有一定差异性,其中湖北样品检出率最高,达100%,云南样品检出率最低,为43.48%。另外,广西地区样品与其它地区的样品相比而言症状表现较复杂,对比检测结果发现,在一些CYVCV检测为阳性的柑橘品种叶片上并未表现出柑橘黄化脉明病的典型症状,这表明CYVCV在不同柑橘品种上可能具有症状上的差异,可能还有潜隐危害的特点。本研究对广西样品进行了针对柑橘上3种可能感染的病毒柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)及苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的检测和分析,结果表明,CTV的检出率最高,达到82.14%,而且50%以上样品检测出病毒复合侵染,表明广西柑橘上的复合侵染严重。为了明确不同地区分离物的遗传多样性,本研究测定了受CYVCV感染的5个分离物全序列(YN-RL、SC-AY、HB-WH、GX-NNX及GX-NNZ),并对其进行了基因组结构分析。结果表明,所获得的所有分离物均具有与已知CYVCV相似的基因组结构,基因组长度在7529 bp~7531 bp之间。对采自世界不同地区的40个CYVCV分离物进行系统进化分析,结果显示中国分离物具有一定的地理相关性,与寄主相关性不明显。此外,群体中性检测参数D值达到显著负值,这表明CYVCV群体呈现正在扩张的明显趋势。重组分析结果显示,在40个分离物中存在1个重组事件和4个潜在的重组事件。遗传多样性分析发现,CYVCV群体在各区段均呈现较低的核苷酸多样性。CYVCV群体的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为1.000±0.006和0.01629±0.00192,表明CYVCV群体具有丰富的遗传多样性。TGBp3区变异最大,TGBp1、RdRp和TGBp2区的平均核苷酸变异位点较多,P23的平均核苷酸变异位点最少。IR2区的Hd值和Pi值分别为0.192±0.083、0.01190±0.00572,大于编码区P23的Pi值,小于编码区RdRp、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP区的Pi值,这表明CYVCV群体内TGBp3区的遗传变异最大,受到的选择压力较弱;编码区P23较为保守,其受到的选择压力较强。本研究以四川柠檬、湖北柠檬、广西显症香橙及广西无症香橙为材料,分别构建了CYVCV TGB、CP和P23基因的15个自然种群SC-AY-TGB、YN-RL-TGB、HB-WH-TGB、GX-NNX-TGB、GX-NNZ-TGB、SC-AY-CP、YN-RL-CP、HB-WH-CP、GX-NNX-CP和GX-NNZ-CP,SC-AY-P23、YN-RL-P23、HB-WH-P23、GX-NNX-P23、GX-NNZ-P23,并对各个种群的遗传结构、变异特点及碱基突变类型进行了分析。结果表明,CYVCV具有准种‖结构,随机两个地区之间未发现完全相同的克隆。在15个种群中,各种群主序列均不占据绝对优势,变异序列占比很大,CYVCV突变克隆百分率超过70.00%和突变频率在10~(-3)数量级。四个地区CYVCV TGB、CYVCV CP和CYVCV P23自然种群变异类型全部为突变,其突变频率在同一数量级等级(10~(-3)),但不同地区自然种群间突变频率有所差异。其中,突变频率最高的是广西无症香橙种群(GX-NNZ-P23),为3.17×10~(-3)。突变频率最低的是四川柠檬种群(SC-AY-TGB),为1.27×10~(-3)。本研究种群CYVCV TGB有明显的T→C碱基突变倾向,种群CYVCV CP有明显的A→G碱基突变倾向,种群CYVCV P23有明显的T→C和A→G碱基突变倾向。CYVCV TGB种群碱基突变主要分布于TGBp1区和TGBp2区的5‘端,TGBp3区存在较少碱基的突变现象,这表明在CYVCV TGB种群内TGBp1和TGBp2变异程度较高,TGBp3较为保守。;CYVCV CP种群碱基突变呈均匀分布;CYVCV P23种群碱基突变分布在3‘端和5‘端,中部分布较少。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.66
【部分图文】：

柑橘,样品,质量比较,浓度

测定 RNA 浓度，用分光光度仪测得 RNA 浓度为 396.44 ng/μL OD260/OD280 的比值为 1.87。说明提取总 RNA 的质量比较好，可用于后续的实验（图 2.1）。图2.1 中国四个地区柑橘病叶总RNAFigure 2.1 Total RNA of Citrus samples from four regions in ChinaM：Marker2000+ 1:云南样品, 2: 四川样品, 3: 湖北样品, 4: 广西样品M：Marker2000+ 1 sample from Yunnan provice, 2:sample from Sichuan provice, 3: sample from Hubei priovince,4: sample from Guangxi provice3.1.2 RT-PCR 检测结果35 Cycles

检测结果,样品,柠檬,香橙

提取所有病样的总RNA，利用CYVCV的特异性引物进行PCR检测，结果表明从86份样品中有56份样品能够扩增得到预期约614bp的条带，与阳性对照扩增条带大小一致（图2.2），我们对每个地区每个样品的检出情况进行统计（表2-2）。图2.2 部分样品CYVCV RT-PCR检测结果Figure 2.2 The detection of CYVCV by RT-PCR注：M1：Marker2000+, 1-19: 部分样品, 20：阳性对照, 21：阴性对照Note：M: Marker5000, 1-19:particial samples, 20: Positive control, 21: Negative contro.表 2-2 柑橘样品 CYVCV RT-PCR 检测结果Table 2-2 Detection of CYVCV in citrus samples by RT-PCR样品编号Sample No检测结果Detection resultsYN-NM 1-11 - - + + + + - + + + +YN-YZ 1-12 - - - + - - - - - + - -HB-GJ 1-5 + + + + +SC-NM 1-15 + + + + - - + + + + + + + + +SC-NM 16-30 + + + + + + + + + - + + + - +GX-XC 1-15 + - + + - + - + - + - - + -GX-XC 16-30 - + - - - + - - + + + + + +注：“+”表示检测呈阳性；“-”表示未检出该病。YN-NM 1-11 表示云南柠檬样品 1-11 号、YN-YZ 1-12 表示云南柚子样品 1-12 号、HB-GJ 1-5 表示湖北柠檬样品 1 号、湖北其他柑橘样品 2-5 号、SC-NM 1-15 表示四川柠檬样品 1-15 号、SC-NM 16-30 表示四川柠檬样品 16-30 号、GX-XC1-17 表示广西香橙样品 1-15 号、GX-XC16-30 广西香橙样品 16-30 号，其中 GX-XC-7、GX-XC-9 表示健康香橙株。Note: “+” positive samples; “-” negative samples3.1.3 CYVCV 在各省不同寄主样品中的检出率进一步分析发现，在云南采集的12份柚子样品中，有2个样品检测出CYVCV，检出率为 16.67%；在云南采集的 11 份柠檬样品中，有 8 个样品检测出 CYVCV

广西,样品,病毒,条带

第二章田间样品中 CYVCV 的 RT-PCR 检测区样品中 4 种病毒的 RT-PCR 检测YVCV、ASGV、CTV、CTLV 特异性检测引物，CTL：F /R，ASGV-JC：F/R，CTV-JC：F/R。提取广西样品的NA，PCR 检测。实验结果发现，在 28 份香橙样品中，预期约 614bp 的条带，与 CYVCV 阳性对照扩增条带大小有 7 份样品能够扩增得到预期大小 889bp 的条带，与 CT小一致，鉴定为 CTLV。有 7 样品能够扩增得到预期大小 7性对照扩增条带大小一致，鉴定为 ASGV。有 23 份样品能61bp 的条带，与 CTV 阳性对照扩增条带大小一致，鉴定究对 28 份样品中这 4 种病毒的检测情况进行了统计（表

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