小麦蓝矮植原体SWP6蛋白抑制本氏烟坏死功能的研究

发布时间：2020-09-18 07:41

　　小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)是发生在我国西北地区冬小麦上的植原体病害。早在上世纪50年代,该病害首次在陕西报道,之后扩展到甘肃,宁夏和山西等地。小麦蓝矮病是由小麦蓝矮植原体侵染引起的病害,由介体昆虫异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)传播,近些年由于麦草覆盖技术的推广,使得介体昆虫越冬基数增加,该病害逐渐扩展到黄河中下游干旱区,给小麦生产带来严重损失。本实验室采用Solexa DNA测序方法完成了小麦蓝矮植原体的基因组图谱,对预测的37个分泌蛋白进行了抑制子的筛选和致病性分析,筛选到SWP6蛋白可以抑制BAX引起的本氏烟细胞过敏性坏死反应。然而,SWP6蛋白的功能及作用机理尚未明确,本论文针对小麦蓝矮植原体SWP6蛋白开展了关键功能域鉴定,转录组测序以及亚细胞定位等一系列试验,旨在能够明确SWP6蛋白的功能,取得以下试验结果:1.对SWP6蛋白的同源性、理化性质和空间结构等进行了分析预测。明确了SWP6基因全长618 bp,编码206个氨基酸,编码蛋白分子量大小约为23.8 kDa,等电点pI为6.98,多肽原子组成为C_(1063)H_(1721)N_(269)O_(315)S_(11),疏水性系数为0.120,属于疏水性蛋白。其信号肽切割位点在蛋白N端第30-31个氨基酸,分泌到胞外成熟的分泌蛋白有174个氨基酸,分子量大小约为19.6 kDa。SWP6蛋白包含所有常见的20种氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,比例为13.6%。在第10-30个氨基酸之间存在跨膜区域,二级结构预测SWP6蛋白有3个α螺旋和多个无规则卷曲结构。2.以SWP6的生物信息学分析预测为基础,构建了SWP6的5个功能域缺失突变体。分别命名为pGR107-SWP6DH1、pGR107-SWP6DH2、pGR107-SWP6DH3、pGR107-SWP6DH4、pGR107S-WP6DH5。利用农杆菌介导的外源基因在本氏烟中的瞬时表达技术,在本氏烟中分别瞬时表达5个缺失突变体,通过观察本氏烟叶片症状和对接种叶RT-PCR的检测,明确了SWP6蛋白中第84-113个氨基酸对其行使功能发挥了关键作用。以pCAMBIA1302为骨架载体构建了SWP6和eGFP融合的亚细胞定位表达载体,通过农杆菌介导外源基因在本氏烟中瞬时表达SWP6和eGFP的融合蛋白,确定了SWP6定位在本氏烟细胞膜中。3.通过对SWP6瞬时表达的本氏烟转录组测序结果的初步分析,筛选到差异表达基因有1093个,其中,上调表达基因540个,下调表达基因553个。挑选4个上调和4个下调关键基因进行了qRT-PCR验证,结果表明这些基因差异表达倍数均与测序结果相吻合,为后续SWP6功能的进一步验证提供基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.12
【部分图文】：

长春花,植原体,蓝矮病,小麦

图 1-1 健康长春花和 WBD 植原体感染长春花Fig.1-1 The heathy Periwinkle and wheat blue dwarf phytoplasma disease in Periwinkle2 小麦蓝矮植原体病原学特征与传播介体早年，小麦蓝矮病经常发生在寒冷天气条件下的霜冻或施氮肥较多的土壤麦田。染病害后的显症时间会比较快，所以人们认为小麦蓝矮病是与天气有关的生理病三等（1984）报道了小麦蓝矮病害的发生、表现症状与传播媒介，发现异沙叶蝉蓝矮病专性传播介体昆虫，并且初步研究了异沙叶蝉的生物学传毒特性，但此时小麦蓝矮病是病毒引起的。安德荣等（1991）通过对小麦蓝矮病组织学分析和电，并且用四环素等抗生素对发病小麦进行处理，结果表明小麦被四环素处理对其有明显抑制作用，综合分析说明类菌原体是小麦蓝矮病发病的病原物。张秦风93）根据病原菌，寄主和介体及四环素对病株的敏感性，确定了小麦蓝矮病属于病害，这也是我国发现的首例小麦植原体病害。顾沛雯等（2005）采用巢式 PC带病小麦 DNA，从分子水平证明蓝矮病是植原体病害。3 小麦蓝矮植原体寄主范围与发生规律张秦风等（1992）和相建业等（1994）在陕西省杨凌区、渭南市、宝鸡市等地调

氨基酸序列,植原体,氨基酸序列,基因序列

2.1 试验方法2.1.1 SWP6 氨基酸序列同源性分析在生物信息中心 NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载 SWP6 基因编码的氨基酸序列，利用 NCBI 的在线工具 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对氨基酸序列进行同源性的比对分析。2.1.2 SWP6 蛋白理化特性的分析利用 Expasy 网站在线提供的软件（http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam）进行蛋白基本特性的分析；利用 PSIPRED 软件（http://brylinski.cct.lsu.edu/content/psipred）预测蛋白质二级结构；利用 swiss-model 软件（http://swiss-model.expasy.org/）进行同源建模的三级结构的分析；利用 signalP 软件对蛋白质的信号肽序列进行分析预测；利用在线软件 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质进行跨膜区预测；利用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）进行亲水性预测。2.1.3 SWP6 基因及其氨基酸序列

蛋白信号

图 2-2 SWP6 蛋白信号肽切割位点预测（Hidden Markov models）Fig.2-2 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Hidden Markov models）图 2-3 SWP6 蛋白信号肽切割位点预测（Neural networks）Fig.2-3 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Neural networks）

【参考文献】