苹果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因的鉴定及功能研究

发布时间：2020-09-25 16:24

　　 苹果蠹蛾Cydia pomonella L.(鳞翅目,卷蛾科)是世界上最重要的果树害虫之一,也是我国重要检疫有害生物。国内外研究发现,谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)酶活性的升高是苹果蠹蛾对多种杀虫剂产生抗药性的主要机制。Delta和Epsilon家族GSTs基因主要参与昆虫对化学杀虫剂的解毒代谢和抗药性的形成。然而,苹果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因的鉴定及对化学杀虫剂代谢作用的研究尚不系统和深入。鉴定苹果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因并解析其对化学杀虫剂的代谢功能,对揭示GSTs介导的代谢抗性机制具有重要意义。本文从苹果蠹蛾转录组和基因组数据库中鉴定出所有的Delta和Epsilon家族GSTs基因,并对它们的时空表达模式和杀虫剂胁迫后的表达模式进行了研究;在原核表达系统中表达了部分GSTs重组蛋白,并测定了体外酶动力学参数和杀虫剂对重组蛋白CpGSTd3的抑制活性;通过体外代谢试验,证实了CpGSTd3可以代谢高效氯氟氰菊酯。主要研究结果如下:1.苹果蠹蛾GSTs基因的鉴定通过对苹果蠹蛾转录组和基因组的筛查,共鉴定出29个GSTs基因,其中胞质型GSTs基因26个,微粒体型GSTs基因3个。在胞质型GSTs基因中,包含Delta家族4个,Epsilon家族5个,Zeta家族GSTs基因2个,Theta家族GSTs基因1个,Sigma家族GSTs基因5个,Omega家族GSTs基因3个,未分类GSTs基因6个。其中,Delta和Epsilon家族GSTs基因与近缘昆虫GSTs基因的氨基酸序列一致性分别为42.79-58.80%和31.90-41.12%。2.苹果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因的表达模式分析利用荧光定量PCR(RT-qPCR)对苹果蠹蛾Delta家族和Epsilon家族GSTs基因在不同发育阶段、幼虫的不同组织和高效氯氟氰菊酯胁迫后的表达模式进行分析。结果表明,这些GSTs基因在苹果蠹蛾的各个发育阶段均有表达,其中CpGSTd3、CpGSTe2、CpGSTe3和CpGSTe4主要在幼虫期表达;CpGSTd2、CpGSTd4、CpGSTe1和CpGSTe5基因表达量在雌雄性别间存在明显差异。这些GSTs基因主要在中肠、马氏管和脂肪体等解毒器官中表达,CpGSTd3在脂肪体中不表达。LD_(10)高效氯氟氰菊酯胁迫后,幼虫体内GSTs基因的表达水平在不同胁迫时长下呈现出现上升后下降的现象,仅CpGSTd4和CpGSTe1这两个基因的表达水平与之相反。3.苹果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs蛋白的体外表达及功能分析利用大肠杆菌表达系统,表达并纯化了CpGSTd3、CpGSTd4、CpGSTe2和CpGSTe3重组蛋白。这几个重组表达蛋白的最大反应速率(V_(max))值分别为13.11±0.68μmol/min/mg、1.55±0.11μmol/min/mg、9.71±0.18μmol/min/mg和12.45±0.80μmol/min/mg,米氏常数(K_m)分别为0.63±0.09 mM、0.67±0.12 mM、0.09±0.01 mM和0.31±0.06 mM。体外抑制试验结果表明,高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、醚菊酯、毒死蜱和辛硫磷均可抑制CpGSTd3重组表达酶的活性,其IC_(50)值分别为0.65、0.48、0.29、0.19和0.53mM。体外代谢结果表明,CpGSTd3重组蛋白可以代谢高效氯氟氰菊酯。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S433.4
【部分图文】：

图 1-1 苹果蠹蛾在中国的 3 个扩散阶段及在不同地区的具体扩散路线（徐婧等，2015）ig. 1-1 Illustration of the 3 stages of dispersal for C. pomonella in China and their dispersal routes into different regions (figure adapted from Xu et al., 2015). 扩散阶段与路线，第一阶段为 1987 年之前，第二阶段为 1987 至 2006 年，第三阶段为 2006 年至今；B. 新疆；甘肃、内蒙古及宁夏；D. 辽宁、吉林及黑龙江. Expansion stages and routs，stage 1 is before 1987，stage 2 is 1978 to 2006，stage 3 is from 2006 to now; B. XinjiangGansu，Inner Mongolia and Ningxia; D. Liaoning，Jilin and Heilongjiang.1.2 苹果蠹蛾的生物学特征在我国，苹果蠹蛾一年可发生 2-3 代，但该虫存在明显的世代重叠现象（De Waal.，2010）。苹果蠹蛾以老熟幼虫在树皮下或地表土层内越冬，羿年四月中旬左右开蛹，5 月下旬到 6 月上旬为 1 代幼虫孵化盛期，7 月下旬到 8 月上旬为 2 代幼虫孵期，9 月上旬到下旬间开始陆续滞育越冬（翟小伟，2009）。苹果蠹蛾成虫在夜间产卵，产卵后的 5-10 天幼虫开始孵化。幼虫的整个阶段几乎都在果实内，如果果

图 1-2 苹果蠹蛾幼虫危害状Fig. 1-2 The hazard symptom by C. pomonella苹果蠹蛾的综合防控蠹蛾的防控十分困难，其原因包括：寄主范围广、存在世代重习性等。在苹果蠹蛾的疫区应着力开展铲除措施，而在非疫区则苹果蠹蛾的综合防控措施包括以下几部分：，植物检疫。苹果蠹蛾的自身扩散能力有限，传播扩散主要是敏等，2015）。因此应加强对疫区调运果品的检疫工作，一旦发，来自疫区的包装材料和集装箱等也要严格检查，如果发现疫情采取检疫处理措施。，农业防治。在苹果蠹蛾的发生区，应加强对果园的清洁和管蛀果和地面上的落果，深埋或集中销毁。根据苹果蠹蛾多在树干或春季，人工刮除果树主干与主枝基部的老翘皮进行集中焚烧，

沈阳农业大学硕士学位论文11 CpGSTz2 Zeta MG100870 26 GST like-4 未分类 MG10087412 CpGSTt1 Theta KX500036 27 CpGSTm1 微粒体型 KX50004113 CpGSTs1 Sigma KX500037 28 CpGSRm2 微粒体型 KX50004214 CpGSTs2 Sigma MG100868 29 CpGSTm3 微粒体型 MG10087715 CpGSTs3 Sigma MG100873.2.2 基因组中鉴定苹果蠹蛾 Delta 和 Epsilon 家族 GSTs 基因在这 9 个 ORF 完整的 Delta 和 Epsilon 家族苹果蠹蛾 GSTs 基因中，仅有一个基CpGSTe1）没有在基因组中查找到其所在位置，其余 8 个苹果蠹蛾 GSTs 基因均发所在基因位置（图 2-1）。而这 8 个苹果蠹蛾 GSTs 基因中的外显子数目较类似，个 4 到 6 个不等。

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本文编号：2826795