水稻健康叶片与白叶枯病叶内生微生物群落分析和白叶枯病菌南方菌株生理小种和分子型鉴定

发布时间：2020-09-30 15:54

　　水稻白叶枯病是由水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的世界水稻生产上严重的细菌病害之一。微生物组在植物控制病原物侵染和定植中具有重要的功能,对植物内生微生物种群的分析可揭示其在植物病害发生中的作用。然而,至今未见有关内生微生物组与水稻白叶枯病发生之间关系的报道。因此,本研究采用16S rRNA和ITS测序法,比较分析了云南自然再生水稻病、健叶内生细菌和真菌种群结构。结果表明,与健叶相比,病叶内变形菌门细菌相对丰度显著增加,变形菌门泛菌属和假单胞菌属、放线菌门短小杆菌属、肠杆菌科OTU_365和?-变形菌纲OTU_14丰度显著上升。内生真菌种群以子囊菌门和担子菌门为主。与健叶相比,病叶内生子囊菌丰度显著上升,而担子菌显著下降;丰度变化显著真菌属包括Khuskia、假皮司霉菌属、小光壳属、毛舌菌属、短梗霉、枝孢菌属、漆斑菌属和Paraphaeosphaeria。从来源于云南和广东病叶样品中分离了30株内生细菌菌株,其中9个泛菌菌株和1个假单胞菌株对Xoo具有明显抑制作用。9个泛菌菌株16S rDNA序列也高度相似。其中MSMHa、MSMHe和MSZFNJa具有IAA合成、固氮和ACC脱氨酶活性等植物促生能力,表明它们可能具有水稻促生作用。将ZFZa、GDYCa和MSMHa分别与Xoo按照比例混合接种,发现水稻病斑长度比单独接种Xoo的显著变短,表明这些菌株可能具有明显的降害作用,是潜在的水稻白叶枯病害的生防因子。为明确我国南方稻区Xoo的生理小种组成、优势种群以及遗传多样性,本研究采用Xoo与IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24六个鉴别寄主的毒性互作反应对南方5省(广东、云南、广西、浙江和湖北)稻区Xoo菌株的生理小种进行了分析,同时以与Xoo致病性相关的avrBs3/pthA基因家族成员作为遗传指标的方法,使用tal4基因的SphⅠ片段为探针鉴定了这51个菌株的分子型。结果表明51个菌株可分为6个生理小种和10个分子型;6个生理小种包括R1、R8、R9、R17、R18和R19,其中R8占比高达78.43%、为优势生理小种,R17、R18和R19为新的生理小种;10个分子型可分为ClusterⅠ-Ⅳ4个簇群,ClusterⅣ占比最高为67.31%。另外,Xoo菌株生理小种与分子型之间无显著对应关系。综上所述,本研究揭示了水稻白叶枯病健叶片内生细菌和真菌的群落结构,鉴定了内生泛菌菌株的抑菌、促生以及降害作用。此外,明确了我国南方稻区水稻白叶枯病菌的生理小种组成以及遗传结构。本研究结果为进一步对水稻内生微生物组学、水稻白叶枯病害发生机制及其病害生防等进行深入探究提供了科学依据和试验基础。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111.47
【部分图文】：

生长素,显色反应,曲线,生理生化性质

%的甘油中备用。为鉴定病叶中各个分离物的分类地位，Xoo 的鉴定使用引物 OGTTGTGAAAGCCCTG-3’和 OSR1:5’-CGGAGCTATATGCCGTGC-3’（阙海勇，2采用 16S rDNA 的通用引物 27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)(Morontabarrios et al., 2018) ，PCR 产物，序列经 NCBI BLAST 搜索最相似种，之后上传至 GenBank 数据库，登录号268-MK578297。泛菌属菌株生理生化性质的测定定 9 个 Pantoea sp.菌株的促生特性如生长素 IAA 的产生、溶磷作用、ACC 脱氨用以及菌株的其他生理生化性质如胞外多糖(EPS)的产生、运动性、胞外脂酶和性。具体步骤如下所示，全部实验至少重复三次。长素 IAA 的产生：菌属菌株接种到含有 1g/L 色氨酸的 LB 液体培养基中，28℃ 振荡培养 3 天。取 0r/m ，离心 5min，取 200 L 上清液加到 96 孔板中，与 100 L salkowski’s 试置 30 分钟，在波长 530nm 下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的 IAA 标准品（55, 1 , 0.5 ,0 mg/mL)制作标准曲线，计算 IAA 的浓度。标准曲线如图：

水稻白叶枯病,水稻白叶枯病菌,PCR检测

MSMHa 与 PXO99A混合接种于水稻成株期叶片（每个处理始终保持 PXO99A的浓度为OD600=0.8），以单独接种 PXO99A和单独接种 ZFZa, GDYCa, MSMHa 为对照。14 天过后，观察并记录叶片病斑的长度。2.3 结果与分析2.3.1 样品的症状及病原物的检测为了揭示健康水稻叶片(healthy)和水稻白叶枯病叶(BB)的内生菌群落结构，采集了九个不同的水稻品种的健康和发病的叶片包括两个对 Xoo 感病的品种，两个携带抗性基因的品种以及五个云南当地的品种。图 2-1 A 显示了采集样品时九个水稻品种白叶枯病发病的症状，可以看到明显的沿叶脉扩展的灰白色的病斑。之后将样品进行平板分离实验，可以分离到到明显的黄色菌落如图 2-1B，并且利用水稻白叶枯病菌的特异引物对 OSF1/OSR1 进行 PCR 鉴定，以水稻白叶枯病菌的菌株 PXO99A为阳性对照，结果显示病叶(A-I)B 中均存在水稻白叶枯病菌（图 2-1 B 和 C）。健康的样品(A-I)H 未观察到明显的水稻白叶枯病症状。水稻健康叶片和病叶的相应部位（图 2-1A中黑色框框所选部位）用于后续的 16 sRNAgene 和 ITS 分析。

曲线图,曲线图,测序,序列

中国农业科学院硕士学位论文第二章水稻健康叶片和白叶枯病叶内生微生物群落分析2.3.2 测序数据总体分析测序一共得到 16S rDNA V4-V5 区高质量序列 4,223,941 条，按照 97%的阈值将其归入 855个 OTUs，每个样品平均含有 78,221 ±5691 序列。这些中有 18 个 OTUs(2,776,979)被分配到水稻的叶绿体；6 个 OTUs(378,037)分配到水稻的线粒体。叶绿体和线粒体的 OTUs 在计算相对丰度时保留，但在考虑内生细菌的群落结构时去除。对于内生真菌群落，一共得到了高质量 ITS1 序列3,814,684 条，每个样品平均含有 70642 ±14,949 条序列，这些序列被归入了 1408 个 OTUs（每个样品平均含有 226 ±114 个 OTUs）。稀释曲线结果表明测序深度在 61415 reads，各个样品内生细菌群落的可观测物种值已达到饱和（图 2-2 A），而内生真菌群落在 25549 reads 时达到饱和（图2-2 B），表明测序深度已足够，已基本涵盖了样品中所有的细菌与真菌。

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