水稻特特普持久抗稻瘟病机制的研究
发布时间：2020-10-08 17:40
水稻稻瘟病是最严重的水稻病害之一,稻瘟病是一种由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻病害,严重影响水稻产量,每年可导致水稻减产约30%。为了减少农业损失,研究水稻与稻瘟病菌之间的相互作用已成为急需解决的问题。因此越来越多的科学家开始研究水稻与稻瘟病之间相互作用的机制,稻瘟病已经成为研究植物与真菌之间相互作用的一种模式菌种。至今,培育广谱、持久稻瘟病抗性的水稻品种是防治稻瘟病菌最有效的方法之一。特特普是一种具有持久稻瘟病抗性的高抗水稻品种。首先我们完成了特特普的全基因组测序,预测出37054个基因,包含455个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复蛋白的基因(NBS-LRR类型基因,简称NLR基因)。我们在特特普品种中利用高通量克隆方法成功克隆了 219个NLR基因,分别转基因至两个感病品种TP309和Shin2中,并用12个不同的稻瘟病菌株进行鉴定。研究表明,其中90个克隆的NLR基因能够对抗至少1种稻瘟病菌株,并且每一个稻瘟病菌株都能够被很多个NLR基因识别,然而有很少的NLR基因能够对抗6种以及以上的稻瘟病菌株,表明特特普NLR基因表现出比较高的抗性冗余现象,同时特特普广谱、持久抗性可能需要多个NLR基因共同作用。为了验证NLR基因是否存在互作,本研究从最简单的两个基因,即成对NLR基因入手,提出了一种快速鉴定成对NLR抗性基因的方法,其中每个基因都作为独立的个体行使不同功能,只有当两个NLR基因同时存在时才能引起植株的免疫反应。我们分别在特特普和日本晴、明恢63、R498其他三种基因组中发现大于20%的NLR基因都是成对基因,在特特普基因组成功鉴定出43对成对NLR基因,在日本晴基因组成功鉴定出47对成对NLR基因。并且选取25对成对NLR基因进行基因敲除,成功得到7对成对NLR基因敲除突变体植株,得到与其功能相对应的表型。综上,本研究深入研究了高抗稻瘟病品种Tetep的持久、广谱抗性的潜在抗性机制,通过对该抗性基因组进行长序列组装、NLR基因注释、并对其中大部分NLR基因进行克隆和抗性鉴定工作,揭示了其具有高度的抗性冗余与复杂的抗性互作网络,同时进一步利用敲除实验验证了成对基因的频繁互作,在此基础上构建了能够快速鉴定NLR基因簇和基因对的分子标记数据库,从而推进新的高抗品种育种的进程。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111.41
【部分图文】：
％］。由于自身免疫引起的遗传负荷，使得基因对的选择压受到负调控作逡逑用，从而限制了基因对的扩张（图１．６Ａ）。与之相反，撤Ｃ与依赖Ｍ？Ｃ的逡逑基因通过适应性进化机制实现功能，Ｗ此依赖ＮＲＣ的基因通过正调控而不逡逑是负调控作用于猫因，从而激活下游免疫反应（阁１．６Ａ）。ＮＲＣ网络的进逡逑化模型会产生大量的基因复制和功能分化，为了维持免疫网络的稳定性，ｓｅｎｓｏｒ逡逑Ｍｌｉ？基因产生大量扩张，ｈｅｌｐｅｒＴＶＬ／？基因存在少量的扩张（图１．６Ｂ），从而应对逡逑快速演化的病原菌＠４］。这种基因网络现象不止存在于ＮＲＣ基因家族中，例如拟逡逑南芥的ＡＤＲ１家族成员（儿Ｄｉ？ｉ，＾４￡？凡？－１２）是ｓｅｎｓｏｒ邋Ｃ／ＶＬ类型基因逡逑（ｉｔｒａ２，似２）和邋７７ＶＬ邋类型基因（ｉｉＰＰ２，５／ＶＣ７，灿幻和邋ＣＨＳ７）介导逡逑免疫反应所必需的［１Ｑ６＿１（）９］。另一个拟南芥基因同样是ｓｅｎｓｏｒ邋７７ＶＬ类型基因逡逑｛Ｒｏｑｌ
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ邋融合序列，称为指导邋ＲＮＡ邋（ｇｕｉｄｅ邋ＲＮＡｓ，ｇＲＮＡｓ），由邋Ｕ６邋启逡逑动ｆ治动的起始为Ｇ，跟随ＰＡＭ邋（ＮＧＧ）之后长度为２０ｂｐ的ｃｒＲＮＡ指导Ｃａｓ９逡逑蛋白对基因组进行剪切过程（图１．７）邋［１３７］。逡逑到目前为止，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统己经广泛于细菌，真菌以及动植物的基因编逡逑辑过程。在植物中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统已经成功运用到拟南芥，水稻，烟草和高逡逑粱上［１３８＿１４３］，最早关于ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系统的研宄表明成功将靶位点插入碱基，以逡逑不同的效率敲除靶基因的功能。进一步的研宄表明敲除成功的拟南芥和水稻基因逡逑能够稳定遗传给下一代［１４４，１４５］。为了同时敲除多个基因，将不同基因的ｇＲＮＡ构逡逑建到同一质粒，然后指导Ｃａｓ９蛋白锚定到不同基因位点，实现基因的功能敲除逡逑１４９逡逑0逡逑２０逡逑
邋ｖ２．３邋？０邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｎａｌｖｔｉｃａｌ－逡逑ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｍｔｔ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）进行处理得到ｓｕｂｒｅａｄｓ邋（图２．３）。通过筛选除掉长度低于逡逑５００ｂｐ邋或者是读长小于邋０．８邋的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ，剩下的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ邋利用邋Ｃａｎｕ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｒ邋ｖｌ．４逡逑（参数设置“ｇｅｎｏｍｅＳｉｚｅ＝４４９ｍｏｖｓＭｅｍｏｒｙ＝４０ｇ－１００ｇ”，其余为默认参数）进行基逡逑因组草图的组装［１４９］。组装得到的ｃｏｎｔｉｇｓ经过ＳＭＲＴ分析软件当中的Ｑｕｉｖｅｒ工逡逑２７逡逑
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111.41
【部分图文】：
％］。由于自身免疫引起的遗传负荷，使得基因对的选择压受到负调控作逡逑用，从而限制了基因对的扩张（图１．６Ａ）。与之相反，撤Ｃ与依赖Ｍ？Ｃ的逡逑基因通过适应性进化机制实现功能，Ｗ此依赖ＮＲＣ的基因通过正调控而不逡逑是负调控作用于猫因，从而激活下游免疫反应（阁１．６Ａ）。ＮＲＣ网络的进逡逑化模型会产生大量的基因复制和功能分化，为了维持免疫网络的稳定性，ｓｅｎｓｏｒ逡逑Ｍｌｉ？基因产生大量扩张，ｈｅｌｐｅｒＴＶＬ／？基因存在少量的扩张（图１．６Ｂ），从而应对逡逑快速演化的病原菌＠４］。这种基因网络现象不止存在于ＮＲＣ基因家族中，例如拟逡逑南芥的ＡＤＲ１家族成员（儿Ｄｉ？ｉ，＾４￡？凡？－１２）是ｓｅｎｓｏｒ邋Ｃ／ＶＬ类型基因逡逑（ｉｔｒａ２，似２）和邋７７ＶＬ邋类型基因（ｉｉＰＰ２，５／ＶＣ７，灿幻和邋ＣＨＳ７）介导逡逑免疫反应所必需的［１Ｑ６＿１（）９］。另一个拟南芥基因同样是ｓｅｎｓｏｒ邋７７ＶＬ类型基因逡逑｛Ｒｏｑｌ
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ邋融合序列，称为指导邋ＲＮＡ邋（ｇｕｉｄｅ邋ＲＮＡｓ，ｇＲＮＡｓ），由邋Ｕ６邋启逡逑动ｆ治动的起始为Ｇ，跟随ＰＡＭ邋（ＮＧＧ）之后长度为２０ｂｐ的ｃｒＲＮＡ指导Ｃａｓ９逡逑蛋白对基因组进行剪切过程（图１．７）邋［１３７］。逡逑到目前为止，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统己经广泛于细菌，真菌以及动植物的基因编逡逑辑过程。在植物中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统已经成功运用到拟南芥，水稻，烟草和高逡逑粱上［１３８＿１４３］，最早关于ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系统的研宄表明成功将靶位点插入碱基，以逡逑不同的效率敲除靶基因的功能。进一步的研宄表明敲除成功的拟南芥和水稻基因逡逑能够稳定遗传给下一代［１４４，１４５］。为了同时敲除多个基因，将不同基因的ｇＲＮＡ构逡逑建到同一质粒，然后指导Ｃａｓ９蛋白锚定到不同基因位点，实现基因的功能敲除逡逑１４９逡逑0逡逑２０逡逑
邋ｖ２．３邋？０邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｎａｌｖｔｉｃａｌ－逡逑ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｍｔｔ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）进行处理得到ｓｕｂｒｅａｄｓ邋（图２．３）。通过筛选除掉长度低于逡逑５００ｂｐ邋或者是读长小于邋０．８邋的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ，剩下的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ邋利用邋Ｃａｎｕ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｒ邋ｖｌ．４逡逑（参数设置“ｇｅｎｏｍｅＳｉｚｅ＝４４９ｍｏｖｓＭｅｍｏｒｙ＝４０ｇ－１００ｇ”，其余为默认参数）进行基逡逑因组草图的组装［１４９］。组装得到的ｃｏｎｔｉｇｓ经过ＳＭＲＴ分析软件当中的Ｑｕｉｖｅｒ工逡逑２７逡逑
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本文编号：2832552
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