不同稻瘟病菌生理小种胁迫下水稻的转录组学分析

发布时间：2020-10-09 04:10

　　随着生物科学技术的发展,基因组高通量测序技术(High-throughputsequencing),又称“下一代”测序技术(Next-generation sequencing technology)以及基因组三代测序技术的出现,使得对一个物种的转录组和基因组进行精细分析成为可能。而转录组测序已成为研究基因表达的主要手段,转录水平的调控是目前研究最多,也是生物体最重要的调控方式。本文应用二代测序技术,以两个稻瘟病菌生理小种,GUY11(高致病性)和81278ZB15(福建流行病菌)为胁迫因子,对感稻瘟病水稻品种C039的3个抗稻瘟病近等基因系品种,包括CN1,CN-4a和CN-4b,在稻瘟病菌侵染的不同时期进行转录组测序(RNA-seq)。经过对原始RNA-seq数据的过滤、基因组映射、差异表达基因分析与GO注释、抗GUY11候选基因的筛选与功能验证等方面研究,获得如下研究结果:1.供试3个水稻品种对稻瘟病菌81278ZB15均表现抗性,但只有CN-4b对稻瘟病菌GUY11具有抗性。对供试3个水稻品种分别在2种稻瘟病菌胁迫24h和48h的样本的转录组测序结果表明,各样本的高质量测序数据占转录组数据的比例在92.74-95.41%间。以水稻粳稻品种日本晴(Nipponbare)为参考基因组,利用TopHat工具将测序reads比对到参考基因组上,各样本测序reads比对上的比例分布在76.8%至85.2%之间,其中外显子的比例高于74.5%,且序列在基因的5'-3'方向分布均匀。这些结果说明转录组测序数据质量较高,可用于下一步的基因差异表达分析。2.应用Cuffdiff软件分析不同水稻品种在不同稻瘟病菌侵染下的转录组数据,获得不同稻瘟病菌胁迫下不同水稻品种中显著差异表达的基因。两种不同稻瘟病菌侵染24h,各品种中差异表达基因数量高于被侵染48h差异表达基因的数量;且侵染24h时CN-4b中有7062个基因显著差异表达(其中上调表达的基因有2470个),远高于另外2个供试品种的差异表达基因数量(分别为2808和2586个)。上调表达基因的GO注释分析结果表明,水稻CN-4b在胁迫24h时上调差异表达基因的GO注释通路显著差异与供试的另外2个水稻品种,且主要富集在translation(翻译),gene expression(基因表达)。这为下一步筛选抗稻瘟病菌GUY11的水稻基因指明了方向。3.转录组测序结果表明,在稻瘟病菌生理小种GUY11胁迫下,水稻CN-4b中的基因LOC_Os08g13465差异表达,即在GUY11胁迫下,其表达量显著高于另外两个水稻品种,qRT-PCR试验进一步验证了其差异表达结果。然后,应用CRISPR/Cas9技术确认该基因具有抗稻瘟病菌GUY11侵染的功能。转录因子搜索获得该基因两个潜在的转录因子,TRAB1与OSBZ8。且转录因子TRAB1在GUY11侵染24h下CN-4b中的表达量显著高于另外两个感GUY11侵染的水稻品种。由此可见,稻瘟病菌GUY11胁迫24h,CN-4b中转录因子TRAB1被诱导高表达,调控抗GUY11侵染基因LOC_Os08g13465的高表达,启动水稻免疫机制,以抵制GUY11的侵染,这与前述研究发现稻瘟病菌侵染24h是水稻启动免疫反应关键期的结果相一致。本文研究结果初步揭示了水稻抗稻瘟病菌GUY11侵染的机制,为培育抗稻瘟病的水稻新品种奠定了基础。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.111.41
【部分图文】：

序列,内容,转录本,程序名

逑ｉｓｏｆｏｒｍｓ．ｆｐｋｍｊｒａｃｋｉｎｇ包含转录本表达水平信息，ｓｋｉｐｐｅｄ．ｇｔｆ包含未匹配上的转逡逑录本信息。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．ｇｔｆ即为该样本的转录本信息文件，其文件内容见图３－１０，逡逑其前７列为标准的ＧＴＦ格式，最后一列为ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ。其每一列的意义：逡逑（ｌ）ｃｈｒｌ：序列名，染色体或邋ｃｏｎｔｉｇ邋名（２）Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ：逡逑来源，产生该文件的程序名⑶类型：ｅｘｏｎ记录的类逡逑型，一般是ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ或ｅｘｏｎ⑷１：开始位置逡逑（５）邋１０００：结束位置（６）邋１０００：打逡逑分逡逑（７）

稻瘟病菌小种,差异表达基因,差异表达,韦恩图

Ｆｉｇ．３－１２邋Ｖｅｎｎ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＥＧｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋３邋ｔｅｓｔ邋ｒｉｃｅ邋ｕｎｄｅｒ邋２４ｈ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋４８ｈ邋（Ｂ）邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｗｏ邋ｂｌａｓｔ逡逑ｒａｃｅｓ．逡逑对差异表达基因中上调基因进行交集分析，结果见图３－１３。如图３－１３Ａ所逡逑示，３个供试水稻品种在两个稻瘟病菌生理小种侵染的２４ｈ共同上调差异表达的逡逑基因有１０４个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ａ相同的上调差异表达基因有１３４个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ｂ逡逑相同的上调差异表达基因有２７５个，ＣＮ－４ａ与ＣＮ－４ｂ相同的上调差异表达基因逡逑有８５２个。如图３－１３Ｂ所示，３个供试水稻品种在两个稻瘟病菌生理小种侵染的逡逑４８ｈ共同上调差异表达的基因有２１个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ａ相同的上调差异表达基因逡逑有２７３个，ＣＮ－丨与ＣＮ－４ｂ相同的上调差异表达基因有３２个，ＣＮ－４ａ与ＣＮ－４ｂ逡逑相同的上调差异表达基因有７１个。逡逑２５逡逑

稻瘟病菌小种,韦恩图,差异表达基因,水稻品种

Ｆｉｇ．３－１３邋Ｖｅｎｎ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ＤＥＧｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋３邋ｔｅｓｔ邋ｒｉｃｅ邋ｕｎｄｅｒ邋２４ｈ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋４８ｈ邋（Ｂ）逡逑ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｗｏ邋ｂｌａｓｔ邋ｒａｃｅｓ．逡逑对差异表达基因中下调基因进行交集分析，结果见图３－１４。如图３－１４Ａ所逡逑示，３个供试水稻品种在两个稻瘟病菌生理小种侵染的２４ｈ共同下调差异表达的逡逑基因有４９个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ａ相同的下调差异表达基因有２０３个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ｂ逡逑相同的下调差异表达基因有４０４个，ＣＮ－４ａ与ＣＮ－４ｂ相同的下调差异表达基因逡逑有６５４个。如图３－１４Ｂ所示，３个供试水稻品种在两个稻瘟病菌生理小种侵染的逡逑４８ｈ共同下调差异表达的基因有２个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ａ相同的下调差异表达基因逡逑有１１１个，ＣＮ－１与ＣＮ－４ｂ相同的下调差异表达基因有６个，ＣＮ－４ａ与ＣＮ－４ｂ相逡逑同的下调差异表达基因有１０个。逡逑由上可见，在两个稻瘟病菌生理小种侵染的２４ｈ，水稻ＣＮ－４ｂ中有２４７０个逡逑独有的上调差异表达基因

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