竹肉球内生菌多肽的分离纯化以及抗农业致病菌活性研究

发布时间：2020-10-09 08:12

　　竹肉球内生菌又名戈茨肉球菌,是中国传统中药,仅在非洲和亚洲有所发现,在中国,主要分布在川东,藏北,云南西北部等海拔较高的地区。作为中国长期以来的民间传承的抗菌消炎药,近年来又在抗癌方面崭露头角,但对其化学成分进行的研究报道却很少,因此对其含有的生物活性物质的研究与开发,具有非常重要的意义。本论文通过盐析法对竹肉球内生菌进行浸提,离心,沉淀,最后通过冻干的方法得到竹肉球内生菌(Engleromyces goetzei P.Hennings)的粗提物,并进行对该粗提物的抑菌活性试验,结果表明该粗提物对农业致病真菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用。再经分子筛G-25凝胶柱纯化后得到的产物,经茚三酮和双缩脲定性反应证明该产物为粗多肽,采用滤纸片法和平板对峙法,以抑菌圈为指标进行抑菌活性检测,结果表明对农业致病真菌的菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中,对小麦赤霉病菌(Gibberella zeae),核果炭疽病菌(Drupe anthrax)和茄子黄萎病菌(Verticilllium albo-atrum)的抑菌活性最高,IC_(50)分别为8.65μg/m L,9.48μg/m L和8.94μg/m L。并让抗菌肽在酸碱,高温,酶解和有机溶剂环境下对其稳定性进行研究,结果表明除了有一定的溶剂选择性和α-淀粉酶,胃蛋白酶对其有一定的水解性之外,该抗菌肽具有很强的稳定性。用HPLC对粗多肽进一步纯化,得到电泳纯的抗菌肽,并通过质谱认定该抗菌肽的分子量大概在5796.0 Da。以上研究,为进一步开发和研究竹肉球内生菌中新型的天然抗菌肽,打下了理论基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ28;S481
【部分图文】：

冻干,样品,抑菌活性,双缩脲反应

图 2.1 粗多肽冻干样品.2. 1 The Lyophilized Sample of Crude Polypep实验缩脲试剂反应为作为一种定性试验，主要均显阳性（在双缩脲反应中，反应液变为紫色物质并且 5 min 内变色颜色未发生得到的黄色絮状物质为多肽类物质且含肽对真菌的抑菌活性测定表 2.1 粗多肽的抑菌效果ab 2. 1 TheAntibacterial Effect of Crude Pepti抑菌活性无菌水土温水甲醇丙酮

抑菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,浸提液

graminearum 的抑菌作用最强。2.4.3.2 竹肉球内生菌粗多肽对细菌的抑菌活性测定如下图2.2所示，粗多肽浸提液对Escherichia coli和Staphyloccocus aureus Rosenbach的抑菌图，可以看出经 30 ℃培养一天后观察粗多肽浸提液纸片和无菌蒸馏水处理过的纸片，发现两者都没有明显的抑制效果，说明该提取到的粗多肽对 Escherichia coli 和Staphyloccocus aureus Rosenbach 无明显的抑制作用。

示意图,凝胶过滤层析,柱材,示意图

如图3.1 所示：图 3.1 凝胶过滤层析原理的示意图Fig 3.1 The Schematic Diagram of Principle of Gel Filtration Chromatography3.3.1.2 凝胶过滤层析的纯化步骤（1）柱材：根据柱型号计算称取适量的 Sephadex G-25 干粉颗粒，将干胶颗粒用沸水水浴 2 h 除去颗粒中的空气。然后通过酸洗和碱洗对其进行消毒处理，最后用无菌抽滤水将酸碱冲洗干净。用蒸馏水浸泡，轻轻搅动柱材（不能出现气泡）然后静置，待柱材沉降后，倾去上层漂浮的颗粒，反复 4-6 次(Wright J G et al, 2008)。（2）层析柱：将层析柱反复清洗干净，与烘箱中干燥备用。（3）装柱：将层析柱固定在与地面垂直的铁架台上，用夹子将其下端出口封住，将处理好的柱材中的水用 2～2.5 倍柱材体积的 1.1%醋酸缓冲液代替，并轻轻搅拌成悬浮液，然后通过玻璃棒引流灌入层析柱中，打开柱的下端出口，让柱材自然沉降，若出现柱材断层和有气泡等现象就必须重新装柱。（4）平衡：通过恒流泵控制流速为 0.8 mL/min，用两倍柱体积的 1.1%的醋酸缓冲液进行平衡。（5）上样与洗脱：将平衡好的层析柱底端出口打开，接通紫外检测仪，将粗多肽样品液 1.5～2 mL 上样

【参考文献】