Kr-h1调控桔小实蝇雌虫生殖的分子机理

发布时间：2020-10-10 12:31

　　 桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是一种危害性非常高的果蔬害虫,常见于热带以及亚热带地区,其寄主范围很广,造成的经济损失严重。由于桔小实蝇具有极强的环境适应以及扩散入侵能力,其已被多个地区和国家当作检疫性害虫而加以隔离,对国际贸易造成了诸多限制。因此,桔小实蝇被一些昆虫学家和生物学家列为世界上最重要的农业害虫之一。目前,桔小实蝇的防控主要以化学药剂为主,然而由于杀虫剂的不合理使用,导致了严重的环境污染并且使其抗药性发展非常迅速。研究表明,昆虫蜕皮激素和保幼激素协同调控其生长发育及生殖进程。因此,开展桔小实蝇生殖进程中关键基因的调控机制研究,将有利于发掘新的杀虫作用靶标,并为实蝇类害虫的持续防控提供新思路和方法,具有重要的研究意义。本论文参考桔小实蝇转录组以及基因组数据信息库,克隆获得了JH信号通路BdMet和BdKr-h1基因的ORF序列,同时对其进行了序列结构以及系统发育分析;利用qRT-PCR解析了桔小实蝇雌虫BdMet和BdKr-h1的时空表达模式;在此基础上探究了JH类似物烯虫酯(Methoprene)处理对桔小实蝇相应基因表达量及卵巢发育进度的影响;最后,利用RNAi技术及拯救实验探索了BdKr-h1在桔小实蝇生殖成熟过程中的生理功能。具体的研究结果如下:1桔小实蝇BdMet和BdKr-h1 ORF的克隆及序列分析依据桔小实蝇基因组和转录组数据库信息,克隆获得JH信号通路BdMet和BdKr-h1(GenBank登录号:MG763072和MG763073)的ORF序列,随后利用软件DNAMAN v.6.03翻译了其编码的氨基酸序列结构。并通过ClustalW、TMHMM、SignalP 4.1、ProtParam等生物信息学软件分析了BdMet以及BdKr-h1的特殊结构,同时采用软件MEGA 5.0完成其系统发育树的构建。2桔小实蝇BdMet和BdKr-h1的时空表达模式解析2.1 BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌成虫不同日龄的表达模式利用qRT-PCR解析JH信号通路BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌虫不同日龄的表达模式发现,BdKr-h1在桔小实蝇成虫期均有所表达,并且在1、3、5、7日龄表达量逐渐上升,7日龄达峰值随后逐渐下降;相对而言,BdMet基因表达量波动趋缓,表达趋势和BdKr-h1基本一致,亦在7日龄表达量最高,暗示其在桔小实蝇生殖成熟进程中扮演重要角色。2.2 BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌成虫不同组织的表达模式综合分析了BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌虫马氏管、脂肪体、后肠、中肠、精巢及卵巢等组织中的表达模式。结果发现,BdMet和BdKr-h1在中肠、脂肪体及马氏管中转录水平均较高,而在精巢及卵巢中表达水平较低。脂肪体是卵黄原蛋白生成的重要场所,对卵黄原蛋白的形成具有重要的促进作用,因此两者在脂肪体高表达进一步暗示其可能参与桔小实蝇的生殖调控进程。3 Methoprene对桔小实蝇卵巢发育进度的影响为探究JH外源类似物Methoprene处理对桔小实蝇雌成虫JH信号通路相关基因及BdVgs表达量的影响,采用点滴法以2.0μg的烯虫酯处理1日龄雌成虫,随后利用qRT-PCR检测BdMet、BdKr-h1、BdVg1以及BdVg2基因表达量的变化。结果表明:Methoprene处理1日龄雌成虫后,BdMet、BdKr-h1及BdVgs转录水平在4、8、12、24 h均出现显著性上调,并且BdVgs表达量上调极显著;与丙酮处理相比,3-7日龄的雌虫经Methoprene处理后其卵巢成熟进度明显加快,表现为卵巢发育形态更为饱满。4 BdKr-h1对桔小实蝇雌成虫生殖调控的功能解析4.1 RNAi沉默BdKr-h1对桔小实蝇卵巢发育和产卵量的影响利用RNAi技术,采用注射法探究了BdKr-h1对桔小实蝇雌成虫生殖的影响。研究表明,BdMet被显著沉默后,其下游BdKr-h1、BdVg1、BdVg2表达量均显著性下调;而BdKr-h1被成功干扰后,BdVg1及BdVg2表达量亦显著下调。相较于dsGFP处理后的对照组,dsRNA干扰后的雌成虫卵巢发育进度明显较慢,卵巢表面积显著较小,产卵量显著下降。4.2 Methoprene联合RNAi对桔小实蝇卵巢发育进度的影响用BdMet以及BdKr-h1的dsRNA干扰4日龄雌成虫2 h后,采用Methoprene点滴处理(2.0μg)注射后雌成虫的前胸背板,并分别于处理24 h、72 h后收集样品,检测Methoprene处理对雌成虫相关基因表达量的影响。结果表明,Methoprene处理,可诱导RNAi后的4日龄雌成虫JH通路及BdVgs的表达量小幅度上调,同时卵巢发育进度表型能够在一定程度上得到恢复。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.661.2
【部分图文】：

图 1.1 桔小实蝇的生长发育历期Figure 1.1 Development and growth period of Bactrocera dorsalis2 昆虫保幼激素（JH）2.1 天然保幼激素（JH）及保幼激素类似物（JHM）天然 JH 是一种倍半萜类化合物，它是在昆虫头部脑后的咽侧体中合成并分泌的，其发挥作用的方式主要是经昆虫的血淋巴而扩散到靶组织进而体现其应有的生理功能。JH 是调控昆虫生长发育、变态与生殖最重要的激素之一[7,8]，在昆虫幼虫期与 20E 产生拮抗作用进而抑制昆虫的早熟变态，导致幼虫发生蜕皮后仍可以保持其特定形态。在末龄幼虫蜕皮前，JH 滴度明显降低，进而引发全变态类昆虫蜕皮化蛹以及不全变态类昆虫进一步发育为成虫[9]，而成虫羽化后 JH 又可以直接作用于昆虫的生殖成熟进程，并促进雄虫附性腺以及雌虫卵巢的生长发育[10]。此外，JH 亦可对一些昆虫的体色、等级分化以及多型现象等进行精确的调控[11,12]。基于侧链长度及环氧化方式的不同，昆虫中有许多不同结构的天然 JH。目前为止，已被发现的天然 JH 有 4-甲基-JH I、JHB3、JH 0、JH I、JH II、JH III、

昆虫体内几种主要天然 JHs 和 JHMs（如烯虫酯、吡丙醚、苯氧威）的结构示意图如图1.2 所示[15]。图 1.2 几种主要的天然 JH 以及三种 JH 类似物的化学结构Figure 1.2 Chemical structures of the active insect major natural JHs and three JH mimics2.2 保幼激素（JH）的生物合成途径已有研究表明[15, 16]，天然 JH 通过两个具体阶段最终合成。首先是甲羟戊酸途径，先是以一分子的乙酰辅酶 A 为原料合成法尼焦磷酸，紧接着由法尼焦磷酸最终反应生成天然 JHIII，此合成途径仅现于部分节肢动物中。2.2.1 甲羟戊酸途径甲羟戊酸合成途径是一条在细菌、古细菌以及真核生物中广泛分布的合成代谢通路[17]，该合成途径的正常运作可以合成许多对发育和繁殖至关重要的调控因子。经典的甲羟戊酸合成途径是利用一分子的乙酰 COA 在 8 种催化酶的作用下最终合成法尼焦磷酸的过程[18]。该合成途径中的8种催化酶分别是：AACT、HMGS、HMGR、MevK、PMK、MDD、IDI 以及 FPPS，并且异戊烯焦磷酸以及烯丙基二磷酸会最终反应生成法尼焦磷酸[19, 20]。

西南大学硕士学位论文2.2.2 法尼焦磷酸最终合成天然 JHIII法尼焦磷酸最终反应合成 JHIII 是该合成通路的最后一步，其具体反应进程包含法尼酸的生成和法尼酸的甲基化以及环氧化。法尼酸的合成过程是通过 3 步化学反应并以法尼焦磷酸为底物而完成的，同时被法尼醇脱氢酶和法尼醛脱氢酶法尼酸环氧酶以及保幼激素酸甲基转移酶等催化酶所催化并最终生成，并且法尼酸经过环氧化以及甲基化并最终形成天然 JHIII，其具体的合成路径如图 1.3 所示[11]。
【参考文献】

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1 张彬;刘映红;赵岚岚;周旭;;桔小实蝇研究进展[J];中国农学通报;2008年11期

本文编号：2835197