检测油菜黑胫病菌的LAMP技术建立与应用

发布时间：2020-10-13 06:26

　　 油菜黑胫病(blackleg of oilseed rape)和油菜茎基溃疡病(stem canker of oilseed rape)分别由Leptosphaeria biglobosa(Lb)和L.maculans(Lm)引起,其中Lb含6个亚类,包括芸薹亚类(L.biglobosa‘brassicae’,简称Lbb)和加拿大亚类(L.biglobosa‘canadensis’,简称Lbc),危害油菜的Lm只有一个亚类,即Lm芸薹亚类(L.maculans‘brassicae’,简称Lm)。目前,我国油菜产区仅发现Lbb和Lbc存在,没有Lm存在。因而,Lm是我国的一个对外检疫对象。Lb的两个亚类(Lbb和Lbc)和Lm在油菜上造成的症状相近,其培养特征相似,难以鉴定。本研究基于环节导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)建立了一种高效快速、准确灵敏、简便易行的检测体系,对Lm、Lbb和Lbc实施高通量快速检测。取得的主要研究结果如下:(1)根据ITS-rDNA序列设计了检测Lb(包括Lbb和Lbc)以及Lm的特异性LAMP引物,并对环引物及其数目进行了筛选,最终确定保留了一条环引物检测Lb,保留两条环引物检测Lm。利用了RAPD技术(Random Amplified Polymorphic DNA)获得了特异性检测Lbb的LAMP引物,根据Lbc的ITS序列,利用人工碱基错配原理获得了特异性检测Lbc的LAMP引物。(2)以LAMP检测Lb体系为例,优化了反应体系中的试剂浓度(dNTPs、Mg~+、F3/B3、FIP/BIP、LF/LB),明确了最适的LAMP反应体系,并对反应时间和温度进行了优化,明确了最佳反应温度为65℃,最佳反应时间为40 min。对检测Lb、Lbb、Lbc和Lm这4个LAMP体系的特异性、灵敏性和实用性等进行了评估。结果表明:所设计的4组引物特异性好,能特异性检测出目标真菌,而对杂菌及近缘种真菌则不能扩增。检测灵敏性高,对目标真菌模板DNA的检测极限达到fg级,较常规PCR的灵敏度提高100~1000倍。而且具有实用性,可用于检测病组织中的目标真菌,也可用于快速鉴定Lbb、Lbc和Lm。(3)对提取目标真菌和病组织中的DNA方法进行了优化,利用TE缓冲液和NaOH溶液分别对目标真菌菌丝、分生孢子以及油菜病组织进行裂解,以释放其中的DNA,整个提取过程仅用时2 min,提取的DNA能满足LAMP检测要求。从DNA提取到完成LAMP反应仅需1 h。上述研究结果为快速准确及高通量检测Lbb、Lbc和Lm奠定了技术基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.654
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.油菜黑胫病及其危害
        1.1.油菜黑胫病和茎基溃疡病研究简史
        1.2.油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌分类
        1.3.病害循环、寄主范围及危害症状
        1.4.油菜黑胫病和茎基溃疡病全球分布及流行
        1.5.油菜黑胫病和茎基溃疡病对我国油菜生产的潜在威胁
        1.6.油菜黑胫病和茎基溃疡病防治方法
    2.油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌检测技术
        2.1.传统鉴定技术
        2.2.基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术
        2.3.环介导等温扩增(LAMP)检测技术
    3.本课题的意义和研究内容
        3.1.课题的意义
        3.2.课题研究内容
第二章 油菜茎基溃疡病菌LAMP检测技术建立与应用
    1.试验材料
        1.1.供试菌株
        1.2.主要试验仪器
        1.3.培养基
        1.4.试验试剂
    2.试验方法
        2.1.菌株的活化、培养和收集
        2.2.菌株基因组DNA的提取
        2.3.引物设计
        2.4.LAMP检测Lm体系建立以及反应条件优化
        2.5.LAMP产物判断方法
        2.6.特异性检测
        2.7.LAMP和 PCR灵敏度检测
        2.8.实用性检测
    3.结果与分析
        3.1.检测Lm的 LAMP反应条件
        3.2.LAMP引物检测的特异性
        3.3.LAMP检测Lm的灵敏度
        3.4.LAMP检测Lm的实用性
    4.讨论
第三章 检测油菜黑胫病菌的LAMP技术建立和优化
    1.试验材料
        1.1.供试菌株
        1.2.主要试验仪器
        1.3.培养基
        1.4.试验试剂
    2.试验方法
        2.1.菌株活化、培养和菌丝收集
        2.2.基因组DNA提取
        2.3.引物设计
        2.4.检测Lb的 LAMP体系建立以及反应条件优化
        2.5.LAMP产物判断方法
        2.6.特异性检测
        2.7.LAMP和 PCR检测灵敏度测定
        2.8.实用性检测
    3.结果与分析
        3.1.LAMP反应体系的优化
        3.2.LAMP引物特异性
        3.3.LAMP检测油菜黑胫病菌的灵敏度
        3.4.LAMP检测油菜黑胫病菌的实用性
    4.讨论
第四章 检测油菜黑胫病菌亚类的LAMP技术建立与应用
    1.试验材料
        1.1.供试菌株
        1.2.主要试验仪器
        1.3.培养基
        1.4.试验试剂
    2.试验方法
        2.1.菌株活化、培养和菌丝收集
        2.2.Lbb和 Lbc基因组DNA的提取
        2.3.引物设计
        2.4.LAMP体系建立以及反应条件优化
        2.5.LAMP产物判断方法
        2.6.特异性检测
        2.7.LAMP和 PCR灵敏度检测
        2.8.实用性检测
        2.9.DNA快速提取方法优化
    3.结果与分析
        3.1.LAMP反应体系优化
        3.2.LAMP检测Lbb和 Lbc的引物特异性
        3.3.LAMP和 PCR检测Lbb和 Lbc的灵敏度
        3.4.LAMP检测Lbb和 Lbc的实用性
        3.5.LAMP对Lbb的快速鉴定
    4.讨论
第五章 全文总结和展望
    1.总结
    2.展望
参考文献
攻读硕士期间发表的专利
致谢

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本文编号：2838854