大豆孢囊线虫ISSRs标记的分子多样性及遗传分化

发布时间：2020-10-20 18:48

　　 大豆孢囊线虫(SCN)是我国大豆产区最严重的病害之一,严重影响大豆的产量和品质,已成为制约我国大豆产业发展的瓶颈。本研究选用ISSRs分子标记技术,将从核DNA水平研究中国境内大豆孢囊线虫17个不同地理种群的遗传多样性及遗传分化水平,从而阐明大豆孢囊线虫在中国的传播与扩散机制,为大豆孢囊线虫病的可持续控制提供理论依据。主要研究结果如下:(1)2009年~2017年在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、河南、江苏、安徽、湖北、浙江、福建、江西、广东、广西、贵州等17省116县开展大豆孢囊线虫病害调查,共采集336份样土,其中16省105县256份样土有孢囊线虫检出,总检出率为76.20%。我国东北大豆产区齐齐哈尔孢囊密度最大,孢囊数达366.8个/200g土,其次为松原283.0个/200g土;黄淮地区山西孢囊检出数量最多,平均孢囊数为28.3/200g土;华南等地为零星分布,偶有发生,平均孢囊数为0.8~3.5个/200g土。(2)分离获得19个种群孢囊线虫,经形态学鉴定,认定17个种群为大豆孢囊线虫,2个种群为旱稻孢囊线虫,扩增146头孢囊的rDNA-ITS区,测序并上传NCBI注册,用Neighbor-Joining方法聚类建树,17个群体与大豆孢囊线虫亲缘相似度达98%,2个种群与旱稻孢囊线虫为同一分支,与形态学结果一致。从ITS分子特征上,17个大豆孢囊线虫群体ITS片段的差异小于2%,2个旱稻孢囊线虫群体ITS片段的差异小于1%,表明ITS用于孢囊线虫的分类合适,是孢囊线虫DNA条形码的潜在选择基因,种群间遗传多样性与遗传分化无法体现。(3)通过参考文献选定12条ISSRs引物,筛选出对大豆孢囊线虫扩增清晰,多态性较多引物,最终确定3条引物PTY26、PTY188和PTY888扩增效果较好,同时建立大豆孢囊线虫ISSRs体系并对各反应因素优化。结果表明当PCR总体系为25μL,dNTPs用量为1.5μL、引物用量为0.8μL、DNA模板用量为1.2μL、DNA Taq聚合酶用量为0.34μL、10×PCR Buffer(Mg~(2+)plus)用量为2.5μL;退火温度55℃时条带较明显且清晰,扩增效果较好,该反应体系可获得大豆孢囊线虫ISSRs清晰且多态性高的图谱以便后续研究分析。(4)统计135头孢囊属于14个地理种群,3条引物共扩增58条谱带,50条为多态性条带,多态位点百分率(PPB)为86.21%。引物PTY26、PTY188和PTY888分别扩增不同长度条带18、19、21条,多态性条带分别15、16、19条,多态位点百分率分别为83.33%、84.21%、90.48%。结果表明供试线虫材料有很好的ISSRs多态性。(5)对供试SCN计算遗传距离得出聚类图,并进行遗传多样性分析,结果表明:本试验中14个地理种群SCN遗传距离范围为0.0984~0.4098,齐齐哈尔和大庆的遗传相似度最低,遗传距离最大;内蒙古扎兰屯和松原的遗传相似度最高,遗传距离最小。通过软件计算出遗传相关数据,有效等位基因数(Ne)为1.3377,Nei’s基因多样性指数(He)为0.2087,Shannon’s多样性指数(I)为0.3287;14个种群总的遗传多样性Ht指数为0.2087,种群内遗传多样性Hs指数为0.0648,基因分化系数Gst指数为0.6893,表明大豆孢囊线虫的遗传变异主要存在于种群间,基因流Nm为0.2255,说明不同地理群体间基因交流较少。进行多态性分析后表明,试验所用SCN种群间地理距离不能作为遗传距离的依据,且14个种群间和种群内有较高的遗传分化和遗传多样性。本研究结果对阐明大豆孢囊线虫的进化机理、研究大豆孢囊线虫的生理小种及毒力变化研究具有重要的理论价值和实践意义。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.651
【部分图文】：

作两年的样品孢囊检出数量为 61 个/200g 土；晋城 4 份样品采集自不 919.3m 的样品孢囊检出数量最多，达 96 个/200g 土，其余 3 份均小于 5 份样品耕作方式均为轮作（前茬玉米），其中种植蒙豆 13 品种孢囊植蒙豆 1137 品种最少。品中各大豆种植品种、各耕作方式均有孢囊检出。土壤类型有黑钙土、草甸土、沙壤土、腐殖土、冲积土、白浆土、草炭土，均有孢囊检中的居多，草炭土其次，两份草甸土孢囊数差距较大，估计和种植品冲积土和腐殖土中最少。1，本试验调查点中黑龙江西部（齐齐哈尔、大庆市）、吉林北部（松公主岭）等地孢囊密度大，达到 200.0 个/200g 土以上，其中齐齐哈个/200g 土，孢囊密度最大，对大豆产量损失及其严重；吉林省西北中部偏南（辽源市）、河北省东部（沧州市）、山东省中部（泰安市）、江苏省西北部（徐州市）、安徽省北部（宿州市）、湖北省中部偏省北部（杭州市）、福建省中部（三明市）、广东省中部（广州市）、安顺市）样品孢囊线虫数在 2.0 个/200g 土以下，危害相对较轻。

最后延伸步骤 72℃ 10min最后保存温度 4℃提取的 DNA 进行 PCR 扩增并设置无 DNA 的阴性对照；扩增后，取 5μL PC 1μL 6×Loading Buffer 充分混合，在 1%的琼脂糖凝胶上 100V 电泳 40 min，用 1μL 4S Green Plus Nucleic Acid Stain 进行染色，用 DL 2000 DNA maker（p）作为凝胶条带的标记，电泳缓冲液为 1×TAE，之后在 Bio-RAD 凝胶成像拍照和保存。有清晰明亮条带的样品扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序、拼 上进行序列比对并上传至 GenBank，得到序列登录号。结果 ITS 扩增结果验在形态学基础上对饱满线虫样品 rDNA-ITS 区进行扩增，舍弃条带不清晰多个条带的线虫样品，最终成功扩增出 146 头孢囊线虫 rDNA-ITS 区，部分图如图 2.1，扩增得到约 1000bp 长度明亮整齐的条带，条带明亮说明 DNA 合之后的 ISSRs 试验。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3.2 使用引物 PTY26 不同退火温度的 ISSRs 扩增试M：DL 2000 maker；1-4：49℃，52℃，55℃，58℃。2 ISSRs amplification of Anneal Temperature by PTY26nes M:DL2000 DNA marker;Lanes 1-4:49℃ ,52℃ ,55℃ ,5NTPs、Taq 聚合酶、引物、DNA 模板四因素进增结果得到一个较为直观的对比，如图 3.3 所示出条带越不清晰，用量在 1.0μL～1.5μL 时效果较时效果相对较好；Taq DNA 聚合酶用量为 0.2μL好；模版 DNA 用量对扩增效果无明显影响。扩 dNTPs 1.5μL、Taq 聚合酶 0.3μL、引物 1.0μLTY26。3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
【参考文献】

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本文编号：2849028