杨树miR472a和miR6445在响应腐烂病菌侵染和干旱胁迫中的功能研究

发布时间：2020-11-01 17:07

　　 杨树(Populus)是我国北方重要的造林树种,具有很高的经济和生态价值,但是其对水分缺乏和病原菌侵染敏感的特点严重限制了其生长与杨树产业的发展。探索杨树对病害和干旱胁迫的响应机制并鉴定关键调控基因,对通过基因工程技术快速培育抗逆性提高的杨树新品种具有重要的理论意义与应用前景。本论文在实验室前期对杨树干旱RNA-seq生物信息分析的基础上,以响应干旱胁迫并上调表达的microRNA472和杨树特异的microRNA6445为研究对象,通过在84K杨(P.alba ×P.glandulosa).中分别过表达或沉默miR472a和杨树特异的miR6445后,探索其在应对干旱胁迫和病原菌侵染中的功能,为基因工程改良杨树抗逆性提供了基因资源与理论依据。具体研究内容如下:1.为了研究miR472a在植物抗病与抗旱中的作用,本论文构建miR472a的过表达以及沉默载体,并利用农杆菌介导转化法在84K杨中进行过表达和沉默miR472a,得到过表达株系miR472aOE(株系)和沉默株系STTM472a(株系)。本文分别用降解组数据、5'RACE、烟草共表达三种方法验证了NBL1为miR472a的靶基因。同时荧光定量PCR显示NBL1、NBL2、NBL3和NBL4在miR472aOE株系中下调表达,在STTM472a株系中上调表达,该结果也验证了它们受miR472a靶向。另外,我们通过荧光定量 PCR 发现了 miR472 触发 phasiRNAs(SIR14、SIR16、SIR17、SIR21和SIR25)的产生。产生的phasiRNAs(如SIR16、SIR21和SIR25等)又靶向调控其他NBS-LRR(如NBL2等)基因,从而使NBS-LRR在正常生长条件下处于极低的表达水平。2.论文对野生型、过表达株系miR472aOE和沉默株系STTM472a分别进行flg22、半活体寄生真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和腐生真菌金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的处理,结果显示:在flg22处理后,miR472aOE株系的H2O2进发和胼胝质堆积明显低于野生型和STTM472a株系;在C.gloeosporioides处理后,野生型叶片中miR472a的表达量减少而NBL1-NBL4的表达量升高,miR472aOE株系的病斑面积明显大于野生型和STTM472a株系;在C chrysosperma处理后,miR472aOE株系具有最小的病斑面积,JA/ET信号通路中的标记基因ERF1基因最早在miR472aOE株系中出现上调表达。以上结果表明miR472a负调控了flg22和C.gloeosporioides触发的免疫反应,而增强了植物对于C chrysosperma的抗性。3.对胡杨进行干旱处理后发现,miR472a在叶片(尤其是幼叶)中上调表达,而在根中下调表达。为了探究miR472a在植物响应干旱胁迫中的角色,论文在不同的转基因杨树株系中进行了干旱处理,发现miR472aOE株系在干旱处理第4天出现萎蔫,而STTM472a株系和野生型在第六天才表现出萎蔫现象,这表明miR472负调控了杨树的干旱胁迫响应。而在正常生长条件下,miR472aOE株系比野生型和沉默株系表现出更大的叶面积和生物量,这表明miR472a正向调控了杨树的生长发育。为了探究NBS-LRR基因是否参与了杨树的干旱胁迫响应,我们选择NBL1与NBL2在拟南芥中的同源基因突变体nbl1和nbl2来进行甘露醇处理下的萌发率实验,结果表明在正常和甘露醇处理条件下这两个突变体的萌发率与野生型之间均无明显差异。我们发现一个预测的miR472a靶基因FB1(F-box)基因在过表达株系中下调而在沉默株系中上调表达,之后通过共转烟草实验证明其为miR472a的靶基因。在甘露醇处理下,FB1在拟南芥中的同源基因突变体fb1种子萌发率和根长增长量明显低于野生型,在自然干旱条件下,fb1突变体更快出现萎蔫现象,这说明FB1正向调控了植物干旱胁迫响应。而在正常条件下,突变体fb1具有更大的根长增长量、叶面积和生物量,这表明FB1可能负调控了生长发育。总之,miR472a可能通过靶向FB1正调控植物的生长发育而负调控干旱胁迫响应。4、为了研究杨树特异的miR6445在植物抗病与抗旱中的作用,本文分析了MIR6445b的启动子序列,发现在其启动子区存在MBS、CGTCA和TGACG-motif等与干旱胁迫和茉莉酸信号相关的顺式作用元件。此后,构建了 miR6445的沉默表达载体,在杨树中沉默miR6445得到转基因沉默株系STTM6445。荧光定量结果表明,miR6445可能的靶基因NAC112、NAC097、NAC152、NAC088在沉默株系STTM6445中表达量上调。对野生型和STTM6445株系进行干旱处理后发现,STTM6445株系在干旱第四天出现萎蔫现象,而野生型在第六天才开始出现萎蔫,STTM6445株系在干旱处理后的相对电导率明显高于野生型。之后,对野生型和STTM6445株系进行腐烂病菌处理实验发现,STTM6445株系在腐烂病菌处理后有更大的病斑面积,这表明miR6445可能正调控了植物的耐旱性和腐烂病抗性。综上,miR472a通过靶向NBS-LRR基因以及触发phasiRNAs负调控杨树对胶孢炭疽菌的免疫反应,而增强植物对金黄壳囊孢菌的抗性;miR472a通过靶向F-box基因FB1负调控植物的干旱胁迫响应信号,而促进植物的生长发育。miR6445可能通过靶向NAC转录因子正调控了杨树抗旱性和对腐烂病菌的抗性。本研究为植物抗旱和抗病育种提供了基因资源和理论基础。
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S763.7
【部分图文】：

ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一类己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ属于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ类蛋白能够直接或间接的识别病原菌的效应因??子来激活免疫反应。这些蛋白包含一个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域，中心??的核苷酸结合结构域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ结合状态调控下游信号的分子开关（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）结构域被认??为是信号识别结构域，它们能够与效应因子互作或与下游信号调控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ结构域在长度和形式上是多样的，与特殊的配体互作的氨??基酸残基与ＬＲＲ能够形成一系列的Ｐ折叠（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．，?２０１１）。在没有病原菌时，??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白处于一种自我抑制的状态，由ＬＲＲ控制的ＡＤＰ结合关闭状态是稳定??的。当Ｃ端的ＬＲＲ结构域感知到效应因子后，会改变蛋白Ｎ端和ＡＲＣ２之间的结合??状态，从而使Ｒ蛋白结构变得疏松更容易产生核苷酸改变。ＡＤＰ／ＡＴＰ之间的变化触??发了蛋白中心ＮＢ－ＡＲＣ、Ｎ端ＴＩＲ／ＣＣ和Ｃ端ＬＲＲ结构域之间的构象变化，活性被??激发。在活性激发态，ＮＢ结构域暴露出来，来触发抵抗信号。ＡＴＰ水解反应使蛋白??又回到结合八〇？的不活跃状态（图１－２）（丁３１如１＾３１．，２００９）。一般认为，１＾？８丄１１１１??

Ｊ？?！丨?／??图１－１模式识别受体（ＰＲＲｓ）与多种病原菌诱导的Ｄ／ＰＡＭＰｓ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐａｔｔｅｒｎ?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ?（ＰＲＲｓ）?ａｎｄ?ｄｉｖｅｒｓｅ?ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ?Ｄ／ＰＡＭＰｓ?（Ｍｅｎｇｉｓｔｅ，??２０１２）??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一类己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ属于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ类蛋白能够直接或间接的识别病原菌的效应因??子来激活免疫反应。这些蛋白包含一个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域，中心??的核苷酸结合结构域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ结合状态调控下游信号的分子开关（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）结构域被认??为是信号识别结构域，它们能够与效应因子互作或与下游信号调控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ结构域在长度和形式上是多样的，与特殊的配体互作的氨??基酸残基与ＬＲＲ能够形成一系列的Ｐ折叠（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．

ｌｉｔ?（ＭＡＰ２Ｋ）和?２０?个?ＭＡＰＫ（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。ＭＡＰＫ?的级联因子、磷酸酶、细胞骨架、微丝微管相关蛋白的激活（Ｐｏｐｅｓｃｕｅｔａｌ．，ＭＡＰＫｓ，例如ＭＡＰＫ３、ＭＡＰＫ４和ＭＡＰＫ６，在生物和非生物胁迫化的特性（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。在非生物胁迫中找ＭＡＰＫ信号在发现上游识别蛋白上，比如发现能够活化下游ＭＡＰＫ的ＭＡＰ２ＫＳ，以及将激酶活化传导到下游效应蛋白并产生生理变化。我们通路是否与酵母高渗透下的ＭＡＰＫ通路相似（Ｈｏｈｍａｎｎ，?２００２）。朱的活化也许是由盐和旱胁迫诱导的次级信号引起的，而不是最初的ｕ，２０１６）。??
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本文编号：2865836