花生蚜神经肽及其G蛋白偶联受体的鉴定和神经肽F对蚜虫取食行为的调控

发布时间：2020-11-02 06:31

　　 神经肽是昆虫体内最多样化的一类信号分子,作为神经激素和神经调质全面调控昆虫的生理和行为。绝大多数神经肽通过与细胞表面的G蛋白偶联受体(GPCR)结合并启动下游信号通路以行使其功能。神经肽GPCR作为新型可替代杀虫剂的靶标,为害虫防治提供了新的可能途径。而实现这一目标的前提是对昆虫神经肽系统的深入研究和理解。取食是对昆虫个体生存和种群存续具有重要意义的行为,果蝇中已经证实神经肽F(Neuropeptide F,NPF)信号系统对调控该行为至关重要。然而该信号系统在蚜虫中的功能却知之甚少。为了加深对蚜虫神经肽系统的了解,本文选择了农业害虫花生蚜Aphis craccivora作为蚜虫的代表,利用RNA-seq技术和tBlastn程序对可能编码神经肽前体及其GPCR的基因进行了全面挖掘。在此基础上对假定神经肽前体的结构和翻译后加工方式进行了分析和预测,并对神经肽GPCR进行了系统发育分析及配体预测。同时,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术明确了候选基因在花生蚜不同发育阶段的表达谱。本文进一步分析了NPF信号系统在蚜虫中的生物学功能;鉴于该信号系统在蚜虫中高度保守,从易操作性考虑选择了体型更大的豌豆蚜Acyrthosiphon pisum(孤雌生殖无翅蚜)作为研究对象。利用qRT-PCR分析了NPF基因及其受体基因NPFR的时空表达模式及对取食和营养状态的响应。并利用RNAi及刺吸电位图谱(EPG)技术来探究NPF信号系统和蚜虫刺探取食行为之间的关系。最后,通过同源建模和分子对接技术,分析了豌豆蚜NPF与其受体NPFR可能的结合位点。本文主要研究结果如下:从花生蚜转录组数据中共鉴定得到抑咽侧体激素(allatostatin,Ast)、抑肌肽(myosuppressin,MS)、胰岛素样肽(insulin-like peptide,ILP)、蜚蠊激肽(leucokinin,LK)、速激肽(tachykinin,TK)、短神经肽F(short neuropeptide F,sNPF)等32个神经肽家族共计40条神经肽前体的编码基因,与已报道其它昆虫的神经肽基因数目基本相当。在此基础上通过软件分析同时参考已报道同源神经肽,对候选神经肽前体的信号肽序列以及酰胺化、焦磷酸化等修饰位点进行了分析,共预测得到164个成熟肽,其中可能具有生物学活性的成熟神经肽超过60个。通过表达谱分析明确了各神经肽基因在不同龄期和不同翅型中的表达模式,重点关注了与昆虫取食调控相关的几种神经肽基因:成蚜期和若蚜期呈现明显差异表达的有LK、NPF和sNPF,在无翅蚜和有翅蚜中呈现差异表达的有AstA、AstB、AstCC、LK、MS、NPF和sNPF。共鉴定获得46条神经肽GPCR的编码基因,其中40条编码A家族GPCR,包括21种神经肽的受体,以及7条孤儿受体;6条编码B家族GPCR,包括利尿激素31(diuretic hormone 31,DH31)受体、DH44受体和色素分散因子(pigment-dispersing factor,PDF)受体。与果蝇等完全变态昆虫相比,花生蚜中没有发现硫激肽(sulfakinin,SK)、黑化诱导激素(corazonin,Crz)、精氨酸加压素样肽(arginine-vasopressin-like peptide,AVLP)和trissin肽以及这些神经肽相应受体的编码基因,推测花生蚜中很可能缺失上述神经肽通路,这一特点与豌豆蚜一致。此外,确定了花生蚜中各神经肽GPCR基因在不同发育阶段的表达谱。与取食调控有关的几种受体基因,在无翅蚜或有翅蚜的不同龄期都呈明显差异表达;在同一龄期的不同翅型中也呈差异表达。NPF基因主要在无翅成蚜头部表达,但在肠道中未检测到该基因的转录;而NPFR基因主要在蚜虫肠道和头部表达且前者表达量大约是后者的2倍。两个基因的表达水平还随发育阶段而不同,暗示该信号系统与蚜虫发育相关。取食和营养状况对NPF表达水平有明显影响,而对其受体基因基本无影响;饥饿导致NPF转录水平上调,而恢复饲喂导致该基因表达量回调至最初水平。注射dsRNA能有效沉默无翅成蚜的NPF基因(干扰效率达到50%),但对NPFR效果甚微。NPF沉默后无翅成蚜的蜜露分泌量显著减少,表明取食量的下降。进一步利用EPG技术检测干扰组蚜虫对蚕豆苗刺探取食行为的改变,发现韧皮部取食的总时间缩短是取食量减少的直接原因。韧皮部取食的减少和第一次韧皮部取食发生延后,表明蚜虫对韧皮部汁液的偏好性下降;首次口针刺探行为的延后以及刺探取食的总时间缩短也同样表明干扰组蚜虫的取食意愿减弱。同时发现,NPF沉默会导致成蚜繁殖力下降,但不会降低其存活率。此外,利用同源建模技术分别构建了豌豆蚜NPFR受体蛋白及其内源性多肽配体NPF的三维结构模型,在此基础上利用分子对接技术可视化两者之间的相互作用方式,结果显示NPF与NPFR的主要结合位点可能是Phe45-Leu5、Arg44-Asp6、Ser41-Phe194和His1-Thr295之间形成的4个氢键,这为设计靶向蚜虫NPF信号系统的激动剂或拮抗剂提供了参考信息。综上所述,RNA-seq可以作为挖掘昆虫神经肽及其GPCR基因的有效技术手段。花生蚜神经肽及其受体的鉴定工作为下一步这些神经通路的功能分析奠定了坚实的基础,而且对开发蚜虫防治的新靶标具有重要意义。同时,发现NPF信号系统参与到了蚜虫取食行为的调节中,起正向调控作用。本研究首次揭示了NPF信号系统与蚜虫取食行为之间的关系。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S433.3
【部分图文】：

相关或不相关的肽。神经肽作为信号分子，要通过与细胞表面特定的受体分子相结合，从而激活胞内第二信使以及下游一系列的级联反应来行使生物学功能。除少数神经肽外，大多数神经肽的受体是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）（图1-1）。一种神经肽可能存在不止一种GPCR，这种现象在脊椎动物中尤为普遍（N ssel &larhammar 2013）。一般情况下神经肽及其GPCR非常保守，一些神经肽信号系统在脊椎动物和无脊椎动物中具有一定的结构和功能同源性，保留了在发育、生长、内稳态或行为方面的基本作用，例如胰岛素样肽（insulin-like peptide, ILP）、催产素/血管加压素（oxytocin/vasopressin）、神经肽Y（neuropeptide Y, NPY）以及速激肽（tachykinin,TK）等（N ssel and Wegener 2011）。图 1-1 神?

的分布模式（引自 N ssel et al. 2019）。蓝色表示的肽也由支配肠道的的多肽尚未在成虫中被证实。一些果蝇神经肽由于缺乏明确的信息并opeptide distribution patterns in Drosophila. The peptides indicated in blfferent CNS neurons that innervate the intestine. Peptides in brackets havult structures. Note that some Drosophila peptides are missing in this figof clear information.的起源种类繁多，有些昆虫神经肽显示出与脊椎动物神经肽高度K。其它神经肽如Proc或EH则是节肢动物所独有的（N sse少有 30 个神经肽信号系统的进化起源已被追溯到原口动物lphick et al. 2018）。神经肽存在于水螅、海蜇、珊瑚和海葵古老的具有神经系统的动物，因此神经肽的起源可以追溯水母（Ctenophora）和扁盘动物中也发现存在神经肽。根据这两个类群比刺胞动物更古老。扁盘动物非常简单，没有肉和真正的消化道，但他们可以协调不同细胞来完成移动

-1 花生蚜各龄期。（A）二龄若蚜；（B）三龄无翅若蚜；（C）三龄有翅若蚜；（D）四龄无翅若蚜；（E）四龄有翅若蚜；（F）无翅成蚜与一龄若蚜；（G）有翅成蚜。. 2-1 Aphis craccivora at different development stages. (A) The 2nd instar nymph; (B) The 3rd instarless nymph; (C) The 3rd instar winged nymph; (D) The 4th instar wingless nymph; (E) The 4th instawinged nymphs; (F) The wingless adult and 1st instar nymph; (G) The winged adult..4 花生蚜样品总 RNA 的提取按照 RNAisoPlus（Takara, Dalian）说明书分别对 2.2.3 节所述样品进行总 RNA 提具体步骤如下：（1）将组织样品放入用液氮预冷的 1.5 ml 离心管中，离心管下部浸于液氮中，用棒充分研磨组织样品；（2）加入适量 RNAiso Plus RNA 提取液，室温静置 5 min，放入提前预冷的 4℃离心机，12000 g 离心 5 min，小心吸取上清液转移至新的离心管中；（3）向上清液中加入 1/5 RNAiso Plus 体积量的氯仿，用手上下剧烈振荡 15 s，无现象后室温静置 5 min，12000 g 4℃离心 5 min；（4）从离心机中小心取出离心管，小心转移上清液至新的离心管中（切忌吸出白
【参考文献】

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本文编号：2866695