地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白及其与harpin蛋白协同抗病作用的研究

发布时间：2020-11-03 00:41

　　 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10是从植物根际筛选获得的一株生防细菌,能较好地抑制多种植物病原真菌,田间防治效果明显。该菌生防机制主要是产生一种抗菌蛋白。为了进一步了解该菌生防机制和进行应用,本文对W10抗菌蛋白进行了纯化鉴定、编码基因克隆和蛋白表达分析,同时为了提高生防效果,本文还初步研究了其与水稻白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1x∞的协同抗病作用,进而了解两类不同信号通路蛋白互作的分子机制,为这两类蛋白的应用奠定基础。利用硫酸铵沉淀和透析袋透析,从地衣芽孢杆菌W10培养上清滤液中获得抗菌粗蛋白,经AKTApurifier(HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution)进一步纯化,再将纯化的抗菌蛋白通过5800超高分辨飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS-MS)进行质谱分析,根据Mascot搜索串级质谱数据鉴定为丝氨酸蛋白酶,并据此设计引物从W10基因组中获得全长序列,经测序含有1个ORF,编码基因1347 bp。经生物信息学分析,该基因编码448个氨基酸残基,分子量为48794.16 Da,等电点为6.04,是一种亲水性蛋白,在二级和三级结构中,a-螺旋和β-折叠所占比例相似,含有Peptidase_S8的保守结构域。通过载体构建,本文对W10抗菌蛋白编码基因进行了克隆,并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统中进行了表达。其中,在大肠杆菌系统中未能成功表达,在枯草芽孢杆菌系统中成功表达,但是表达出的蛋白分子量与上述有点误差,且不具有抗菌活性,初步认为是在表达时氨基酸结构可能有所改变,从而影响了分子量与抗菌活性。同时丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对提取的抗菌蛋白有一定的抑制作用,进一步说明W10抗菌蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性。此外,本文还研究了地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白与Hpa1x蛋白的协同抗病作用。两种蛋白混合处理与各自单独处理相比,能显著增加对番茄灰霉病的防治效果;防卫反应相关基因检测发现,在三生烟中,W10抗菌蛋白诱导了hsr203J、COI1、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,分别涉及HR、茉莉酸信号通路以及植物生长调节基因,Hpa1x∞蛋白诱导了hsr203J、aoxl、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,涉及HR、活性氧代谢及植物生长调节基因。W10抗菌蛋白与Hpa1x∞蛋白混合处理则在三生烟中诱导了上述所有基因不同程度的表达,且表达强度比单独处理有所增加。另外发现,W10抗菌蛋白在转hpalx∞基因烟草中能诱导hsr203J、Ntexp2、NtexC6、COI1、Chia5基因不同程度的表达。因此,这两类蛋白在混合应用时具有协同作用,通过增加相关信号通路和相关基因表达来提高对病害的防治作用。这将为整合生防资源提高生防效果,为开辟地衣芽孢杆菌W10的新的应用途径提供理论基础。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S476
【部分图文】：

植物通过感应病原菌的以ｃ基因调控信号，与经过ＩＩＩ型分泌系统分泌的病原菌效应蛋白??（ｅｆｆｅｃｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓ）（主要是Ａｖｒ蛋白）结合，随后开启级联信号系统，使受侵染植物产??生防御反应，促使表达防卫基因，最终呈现抗性（图１）【６８］。第二部分为如ａ（ｈｒｐａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）??基因，此类基因不是植物病原细菌与植物互作过程中所必需的，它只是有助于寄主致病性??或非寄主上诱导过敏性反应。第三部分是一些非保守的ｋｐ基因［６９－ＴＯ］。??

利用ＤＮＡｍａｎ分析本蛋白的序列后选取了?Ａ７ｗ?Ｉ和ＡｃｏＪ？?Ｉ双酶切位点，本蛋白基因片??段用说〇?Ｉ和双酶切后回收产物，连接至孙〇?Ｉ和及〇及１双酶切过的表达载体??ｐＥＴ－２８ａ（＋）上，构建重组转基因载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）：ｎｖ川（图２）。??Ｘｂｏｌ??／?ＥｃｏＲｌ??＜?ｐＥＴ－２８ａ（＋）?Ｉ??ｖｙ??图２重组质粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）：：ｗｌＯ示意图??９．１．２引物设计及ＰＣＲ扩增??根据Ｗ１０抗菌蛋白基因序列，设计５’端分别带有恐〇?Ｉ和及＂Ｏｉ？?Ｉ酶切位点的引物，进??行ＰＣＲ扩增。??引物如下：ｕｐ：?５，－ａｇｇａａｔｔｇＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧ－３，?（ＥｃｏＲｌ）?，?ｄｏｗｎ：??５５－ＡＴＡｃｔｃｇａｇＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＣ－３５?（恐〇?Ｉ?），５，三个碱基为保护性碱基，??红色字体的为酶切位点，含下划线的为起始密码子和终止密码子。ＰＣＲ反应体系与反应条??件如７．３。??ＰＣＲ产物按照７．２方法进行琼脂糖凝胶电泳检测，按照９．１．３方法进行纯化？??

１．１粗蛋白的提取及活性检测??采用硫酸铵法从地衣芽孢杆菌Ｗ１０培养滤液中提取获得了?Ｗ１０粗蛋白，平板抑菌实??验表明（图４），Ｗ１０粗蛋白可明显抑制番茄灰霉病菌的生长。Ｗ１０粗蛋白经过冻干浓缩??后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示提取的粗蛋白含有两种大小不同的蛋白物质，大小分别接近４４．３??ｋＤａ及２０．１?ｋＤａ?Ｍａｒｋｅｒ条带（图５），其中４４．３?ｋＤａ大小的蛋白条带与之前报道的抗菌蛋??白大小相似，因此可进行下一步蛋白纯化工作。??．０，??图４?Ｗ１０粗蛋白对番茄灰霉病菌的拮抗效果图?图５?Ｗ１０粗蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图??左为清水对照，右为粗蛋白?Ｍ：?Ｐｒｅｍｉｘｅｄ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ｍａｒｋｅｒ?（Ｌｏｗ）；?１：?Ｗ１０粗蛋白??１．２粗蛋白的纯化及活性检测??采用ＡＫＴＡ低压层析系统对提取的Ｗ１０粗蛋白进行纯化，结果如图６，出现３个洗脱??山箪，其中峰Ｉ的面积较大。收集各洗脱峰的洗脱液，经过冻干浓缩后分别进行ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ??电泳
【参考文献】

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本文编号：2867826