烟草花叶病毒对烟草光合组织中蛋白质的影响及防治研究
发布时间：2020-11-10 16:33
烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)作为专性的胞内寄生物,与寄主细胞环境关系非常密切并完全依赖寄主细胞环境,这种依赖性需要病毒蛋白和核酸能够转换寄主因子的正常功能~([1])。这使得病毒病的防治极为艰难。长期以来,研究人员在生物源制剂、化学制剂以及利用基因工程等方面来防治烟草花叶病毒有了许多研究,但是依然没有取得大的进展。因此深入研究TMV侵染寄主免疫的分子基础,有利于研究对TMV的防治。本研究采用iTRAQ技术检测了病毒侵染烟草不同时间段蛋白质组的变化,分析了响应TMV侵染的代谢途径变化并且筛选出关键蛋白;以此为检测靶标,结合抗性基因的表达和产生的病斑数目,检测我们复配的TMV防治剂的效果。实验结果如下:1、对烟草品种K326接种TMV后,采用iTRAQ技术检测了不同时间段蛋白质组表达谱的变化,结果显示12h vs CK中有144个差异表达蛋白质,其中90个上调表达,54个下调表达;24hvsCK有163个差异蛋白,其中90个上调表达,73个下调表达;36hvsCK有178个差异蛋白,其中97个上调表达,81个下调表达。对三组差异表达蛋白进行GO功能注释:结果显示这些差异蛋白质主要反映在“电子载体活性”,“催化活性”,“转运调控”功能领域;生物途径的差异变化主要反映在“代谢过程”,“细胞过程”,“生物调节过程”。2、以整个蛋白质组为背景,P≦0.05为限制条件,对差异蛋白质进行KEGG富集分析,结果显示:接种TMV 12h诱导的差异蛋白分别聚集在“Biosynthesis of secondary metabolites”,“Terpenoid backbone biosynthesis和“Photosynthesis”等途径;接种TMV 24h诱导的差异蛋白主要聚集“在Starch and sucrose metabolism”,“Terpenoid backbone biosynthesis”和“Photosynthesis”等途径;接种TMV 36h诱导的差异蛋白主要聚集在“Protein export”,“Photosynthesis”和“Porphyrin and chlorophyll metabolism”等途径;表明TMV在侵染烟株的36h内,其对光合系统的影响是非常显著的。对这三个时间段TMV诱导的特异蛋白质进行交联分析,结果显示这三个时间段表达的差异蛋白大部分都分别富集在“RNA degradation”,“Porphyrin and chlorophyll metabolism”以及“Photosynthesis”,进一步表明TMV侵染对光合系统的影响。3、接种TMV后,光合途径中上调的蛋白质数目逐渐增加,下调蛋白的数目逐渐减少;而卟啉代谢与叶绿素代谢途径中上调蛋白数目减少,下调蛋白逐渐增多。说明TMV在侵染烟株的过程中,烟株体内的蛋白质出现代偿性表达。通过提高卟啉代谢与叶绿素代谢中一些蛋白的表达水平,代偿性弥补光合系统的减弱,以最大限度维持植物生存的需要。4、通过不同方式给烟株喷施制剂A和制剂B,结果显示:在烟株感染TMV前,施用制剂B,能够提高烟株卟啉代谢与叶绿素代谢途径中关键基因和抗病基因的表达水平以及防御酶活性,增强烟株对TMV的抵抗能力;同时,降低TMV对光合系统的破坏;半叶法检测TMV侵染后烟叶的发病表型,也呈现出制剂B对防治烟草花叶病具有显著效果。
【学位单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.72
【部分图文】：
图 1 Bradford 定量标准曲线标样品的含量测定。 酶切和除盐取 100μg 蛋白质，体积整体调节到 100μL，然后加入 500μL50mM NH4HCO3稀释，加ryspin 酶液；7℃消化过夜 8~16h；样品编号 1 2 3 4 5 6 7 标准品公式 y = 0.4389x - 0.0085 R2 = 0.9907样品吸光度 0.218 0.167 0.194 0.196 0.192 0.165 0.153 0定浓度（μg/μL） 0.087 0.065 0.077 0.077 0.076 0.064 0.059 0稀释倍数 50 50 50 50 50 50 50 样品实际浓度（μg/μL）4.4 3.2 3.9 3.9 3.8 3.2 2.9
SDS-PAGE胶图
两条带的强度明显高于对照，且 36h的样品在 45 与 66.2 kDa 左右处蛋白聚集较多。SDS-PAGE 电泳结果如下：图 2 SDS-PAGE 胶图4.1.2 蛋白质定性分析4.1.2.1 鉴定结果统计本次实验中，质谱产生的二级谱图数、解析的二级谱图数分别为 387554、143349，谱图鉴定率达到了 36%以上，鉴定到的肽段和蛋白数总体情况请参见表 3.2表 4 蛋白质鉴定信息统计总表.样品名总谱图数 鉴定谱图数* 谱图鉴定率 鉴定肽段数* 鉴定蛋白数 Unique-2**ALL 387554 143349 36.99% 27942 4880 3556注：*表示可信度至少为 95%，**表示至少含有 2 个 unique 肽段的鉴定蛋白质数目4.1.2.2 重复性分析重复性分析指的是通过分析生物重复样品数据的再现性，以判断实验操作的重复性和仪器的稳定性，重复性分析主要从同一样品不同生物重复的 CV 值分析角度出发。
【参考文献】
本文编号：2878128
【学位单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.72
【部分图文】：
图 1 Bradford 定量标准曲线标样品的含量测定。 酶切和除盐取 100μg 蛋白质，体积整体调节到 100μL，然后加入 500μL50mM NH4HCO3稀释，加ryspin 酶液；7℃消化过夜 8~16h；样品编号 1 2 3 4 5 6 7 标准品公式 y = 0.4389x - 0.0085 R2 = 0.9907样品吸光度 0.218 0.167 0.194 0.196 0.192 0.165 0.153 0定浓度（μg/μL） 0.087 0.065 0.077 0.077 0.076 0.064 0.059 0稀释倍数 50 50 50 50 50 50 50 样品实际浓度（μg/μL）4.4 3.2 3.9 3.9 3.8 3.2 2.9
SDS-PAGE胶图
两条带的强度明显高于对照，且 36h的样品在 45 与 66.2 kDa 左右处蛋白聚集较多。SDS-PAGE 电泳结果如下：图 2 SDS-PAGE 胶图4.1.2 蛋白质定性分析4.1.2.1 鉴定结果统计本次实验中，质谱产生的二级谱图数、解析的二级谱图数分别为 387554、143349，谱图鉴定率达到了 36%以上，鉴定到的肽段和蛋白数总体情况请参见表 3.2表 4 蛋白质鉴定信息统计总表.样品名总谱图数 鉴定谱图数* 谱图鉴定率 鉴定肽段数* 鉴定蛋白数 Unique-2**ALL 387554 143349 36.99% 27942 4880 3556注：*表示可信度至少为 95%，**表示至少含有 2 个 unique 肽段的鉴定蛋白质数目4.1.2.2 重复性分析重复性分析指的是通过分析生物重复样品数据的再现性，以判断实验操作的重复性和仪器的稳定性，重复性分析主要从同一样品不同生物重复的 CV 值分析角度出发。
【参考文献】
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本文编号：2878128
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