家蚕蛹致敏原蛋白的表达水平差异研究

发布时间：2020-11-14 18:14

　　 家蚕蛹作为一种优质蛋白源,因其营养丰富、蛋白含量高、味道鲜美,一直是人们喜爱的食物之一。但是由于家蚕蛹中存在一些致敏原导致在实际生活中有少数人会发生食入家蚕蛹过敏的情况,这不但制约了家蚕蛹在食品上的应用,还危害着人们的健康。因此深入研究家蚕蛹内的致敏原种类和致敏机理,对开发培育安全的家蚕蛹品种具有重要的意义。本文旨在分析不同品种家蚕蛹致敏原蛋白表达水平的差异,从种质资源的源头筛选开发出致敏性较低且适合食用的家蚕蛹品种,主要研究结果如下:1、家蚕蛹致敏原基因转录水平的差异研究。选择102份不同品种的蚕蛹作为供试材料,利用实时荧光定量技术(qRT-PCR),通过检测不同品种家蚕蛹中7种主要致敏原基因(家蚕假定表皮蛋白30、胰凝乳蛋白酶抑制剂、小热休克蛋白20.8、卵黄原蛋白、几丁质酶、30K家族蛋白、丙糖磷酸异构酶)的转录水平,初步筛选出致敏原基因转录水平较低的家蚕蚕蛹品种。结果发现:1007、4034、4020、2016、2030的蚕蛹体内致敏原基因的转录水平相对较低。2、家蚕小热休克蛋白20.8(HSP 20.8)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI-8A)的原核表达及抗体的制备。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增HSP 20.8和CI-8A基因,连接pET-28a构建原核表达载体,转入至大肠杆菌BL21细胞进行诱导表达。结果显示:扩增得到的基因序列与NCBI数据库中的序列一致,成功构建HSP 20.8和CI-8A的原核表达载体,获得大小分别为28 KDa和47 KDa左右的重组蛋白,符合预测结果,同时成功制备抗体,效价分别为1:51200和1:25600。3、家蚕蛹致敏原蛋白水平的表达差异研究。提取各品种的家蚕蛹总蛋白,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对家蚕蛹总蛋白进行分离,经湿法转膜后利用免疫印迹方法(Western-blot)将上述制备的抗体与分离后家蚕蛹总蛋白进行反应,从而检测蚕蛹中致敏原蛋白的含量。结果显示:2025品种的家蚕蛹中致敏原HSP 20.8和CI-8A的含量最低,认为该品种可以作为相对安全可食用性候选蚕蛹品种进行培育。
【学位单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S881.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 致敏原研究进展
        1.1.1 致敏原概述
        1.1.2 食物过敏的机制
        1.1.3 食物过敏动物模型研究
        1.1.4 致敏原的检测技术
    1.2 致敏原致敏的机理
        1.2.1 致敏原的抗原表位
        1.2.2 致敏原的分子模拟
    1.3 家蚕致敏原的研究进展
        1.3.1 家蚕致敏原的致敏方式
        1.3.2 家蚕致敏的临床表现
        1.3.3 家蚕致敏原的致敏成分
        1.3.4 家蚕蛹致敏原分子生物学研究
    1.4 本研究的目的与意义
    1.5 本研究的主要内容
第2章 家蚕蛹致敏原基因转录水平表达差异
    2.1 实验材料与设备
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验仪器设备和试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 家蚕蛹RNA的提取
        2.2.2 反转录反应
        2.2.3 实时荧光定量分析
    2.3 结果与分析
    2.4 讨论
第3章 原核表达及多克隆抗体制备
    3.1 实验材料与设备
        3.1.1 试剂和实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 RNA提取与反转录反应
        3.2.2 PCR扩增反应
        3.2.3 目的片段胶回收
        3.2.4 目的基因与载体的酶切、纯化、连接
        3.2.5 转化及克隆测序
        3.2.6 重组DNA的筛选和鉴定
        3.2.7 诱导表达
        3.2.8 His柱洗脱
        3.2.9 抗体制备
    3.3 结果与分析
        3.3.1 HSP20.8和CI-8A基因的克隆
        3.3.2 原核表达及抗体制备
    3.4 讨论
第4章 家蚕蛹致敏原在蛋白水平表达的差异
    4.1 实验材料
        4.1.1 设备与试剂
        4.1.2 常用试剂和缓冲液的配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 家蚕蛹总蛋白的提取
        4.2.2 蚕蛹总蛋白浓度定量
        4.2.3 SDS-PAGE分析
        4.2.4 Western-blot检测
    4.3 结果与分析
    4.4 讨论
结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的论文
致谢

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本文编号：2883799