大麦条纹花叶病毒γb蛋白的磷酸化及其与寄主激酶STY46互作的功能分析

发布时间：2020-11-17 19:37

　　 磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰,在植物病毒侵染过程中发挥重要作用。病毒的复制酶、运动蛋白、外壳蛋白和病毒编码的RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)被磷酸化后都可以调节病毒的侵染和致病性。大麦条纹花叶病毒(Barly striosaic virus,BSMV)是一种ss(+)RNA病毒,它编码的γb蛋白在植物防御和病毒反防御的军备竞赛中具有多重功能,但γb蛋白是否存在磷酸化修饰及其对病毒侵染和寄主响应的影响并不清楚。本研究分析了γb蛋白磷酸化的生物学功能,并对本生烟激酶STY46通过与γb蛋白互作负调控BSMV侵染的分子机制进行了初步分析。本研究首先利用丝氨酸磷酸化特异抗体(anti-phosphoserine)检测到BSMVI γb蛋白在受侵染的植物体内存在磷酸化修饰,经体外磷酸化实验和质谱分析,证明γb蛋白可以被本生烟中类PKA蛋白激酶磷酸化,Ser-96是其主要的磷酸化位点。γb蛋白非磷酸化突变体病毒(BSMVS96A和BSMVS96R)诱导双子叶植物和单子叶植物产生细胞坏死反应,病株中的病毒积累量减少,而模拟磷酸化突变体病毒BSMVS96D的致病症状与野生型病毒一致,说明γb的磷酸化状态影响了 BSMV的致病性和病毒积累量。γb蛋白非磷酸化突变体S96A的VSR活性显著减弱,而模拟磷酸化突变体S96D的VSR活性与野生型γb相当。γb蛋白的磷酸化状态不影响其自身互作和多聚化能力,但磷酸化化后可增强其结合21 nt siRNA的能力。这些结果表明,γb蛋白被PKA磷酸化是其发挥VSR活性进而抑制寄主RNA沉默所必需的。除抑制植物RNA沉默外,γb蛋白被PKA磷酸化还能够抑制寄主的细胞坏死反应。利用瞬时表达、转基因植株组成型表达和通过γb缺陷型病毒(BSMV△γb)侵染表达等实验,证明来源于其它病毒的RNA沉默抑制子均不能抑制BSMVS96A引起的细胞坏死反应,只有回补正常功能的Yb蛋白才能有抑制作用。证明磷酸化的γb蛋白对植物细胞坏死反应的抑制独立于其VSR活性,这两种抑制作用在功能上是相互独立的。因此,γb在Ser-96被PKA磷酸化对于维持病毒持续侵染和寄主适度反应的平衡至关重要。除此之外,还发现BSMV yb蛋白与本生烟激酶NbSTY46在体内和体外直接互作,γb的BM结构域(aa 19-47)和STY46激酶家族的保守氨基酸Thr-436分别是互作的关键区和关键氨基酸。NbSTY46的Thr-436突变为A(T436A)后,不仅其自磷酸化活性丧失,而且既不能与γb互作也不能将γb磷酸化。BSMV侵染不影响NbSTY46表达水平,也不改变其亚细胞定位。瞬时表达和转基因组成型超表达NbSYT46激酶均抑制病毒的侵染和复制,而通过转基因下调本生烟NbSYT46的表达可加重BSMV的症状,增加病毒积累量,且NbSTY46对病毒侵染的负调节依赖其激酶活性。超表达NbSTY46不影响γb的VSR活性,但竞争性BiFC的初步结果暗示NbSTY46有可能抑制γb蛋白与复制酶αa的互作。上述研究结果表明,自磷酸化的本生烟激酶NbSYT46通过与γb直接互作并将其磷酸化负调节BSMV的复制,进而抑制BSMV的侵染。这些研究结果为阐明病毒蛋白磷酸化如何平衡病毒的持续侵染和寄主的适度反应,以及植物激酶蛋白在病毒与寄主互作中的防御功能提供了新的科学证据。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S432.41
【部分图文】：

图１－１抗病毒ＲＮＡ沉默通路以及不同ＲＮＡ沉默抑制子发挥功能的机制（Ｃｒｏｒｂａｅｔａｌ．，?２０１５）??植物体内主要包括两种水平的基因沉默：转录水平上的基因沉默ＴＧＳ?（右）和转录后水平的基因沉默ＰＴＧＳ?（左）。??其中ＲＮＡ病毒的ＶＳＲ主要抑制ＰＴＧＳ，?ＤＮＡ病毒主要抑制ＴＧＳ。红色标注代表各个ＶＳＲｓ发挥功能的机制。??植物通过ＲＮＡ沉默途径来抵抗病毒的侵染，为了抵抗植物的抗病毒ＲＮＡ沉默，病毒在长期??进化的过程中产生一类蛋白，称之为病毒编码的ＲＮＡ沉默抑制子（ｖｉｒａｌ?ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ?ｏｆ?ＲＮＡ??ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，?ＶＳＲ）。目前己报道的ＲＮＡ沉默抑制子有５０多种，几乎涵盖了所有的植物病毒属??２??

图１－２?ＴＣＶ?ＣＰ－ＨＲＴ介导的细胞坏死反应模型（Ｚｈｕ?ｅｔａｌ．，?２０１４）??ＨＲＴ主要存在于质膜上，随着ＴＣＶ的侵染，ＨＲＴ可以识别ＣＰ蛋白，此时可以诱导大部分的ＤＲＢ４重新定位到细??胞质中，与ＣＰ互作。ＫＤＳ１通过与ＨＲＴ互作增强ＨＲＴ－ＣＰ介导的细胞坏死反应，ＣＲＴ１通过与ＨＲＴ互作维持其蛋??白稳定性，但二者均不与ＴＣＶＣＰ互作，作者推测ＣＰ介导的ＨＲ反应的激活可能与其减弱ＨＲＴ－ＤＲＢ４的互作相关。??（２）?ＰＶＸ?Ｐ２５蛋白引起的类ＨＲ?（ＨＲ－ｌｉｋｅ）坏死反应??ＰＶＸ的基因组由一条正义单链ＲＮＡ组成，编码三联体运动蛋白（ｔｒｉｐｌｅ?ｇｅｎｅ?ｂｌｏｃｋ，?ＴＧＢ）。其??

旋实验发现ｙｂ在体外确实可以促进ａａ将ｄｓＲＮＡ打开为ｓｓＲＮＡ，而且当丫ｂ丧失结合ｓｓＲＮＡ的能??力时，便不能促进ａａ的解旋能力（Ｚｈａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２０１７）。通过以上结果，Ｚｈａｎｇ等人提出了?ｙｂ参与??ＢＳＭＶ复制的模型（图１－４）：??妙?ｉｆ??ｎｄｓＲｉ?／?多、??１ｖ—?丨丨丨ＩＴ＿?丨?１１１（＋）??、?公／ｂ?＾ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ（．）??＾?▲?Ｙｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｙｂ??．?Ｙｂ?／?Ｉ??７?ＴｂＴｂ（＾ｊ丨丨丨ｉｌｌ丨丨丨ＩｉｉＩｉＩｉｉ川丨丨＂Ｉ川丨丨??（＋）ｇＲＮＡ?Ｖ?＼?％ｍｉｎｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉ??Ｃｙ’ｎｄｉｎｇ??Ｔｒａｎｓ．ａｔ．ｃｎ?Ｖ??图１－４?ＢＳＭＶｙｂ蛋白参与病毒复制的模型（Ｚｈａｎｇ?ｅｌ?ａｌ．，?２０１７）??在复制的初始阶段，ｃｉａ和ｙａ蛋白从亚基因组翻译出来并形成病毒复制复合物（ｖｉｒａｌ?ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ，?ＶＲＣ）。ａａ??复制酶亚基与Ｙａ复制酶相互作用，定位于叶绿体。ＶＲＣ形成后，复制酶可以利用亲本ｇＲＮＡ作为模板合成负链??ｇＲＮＡ，两条链形成ｄｓＲＮＡ。首先，以ｄｓＲＮＡ为模板合成正链ＲＮＡ以利于ａａ和丫ａ复制酶亚基的翻译，随后，合??成负链ＲＮ／＾并且ａａ通过与７ｂ蛋白互作将其募集至叶绿体，通过增强ａａ解螺旋酶活性来促进病毒的复制。??１．１．３?ＶＳＲｓ与宿主蛋白的互作研究??植物通过抗病毒ＲＮＡ沉默途径来防御病毒的侵染，病毒为了成功的侵染植物进化出ＲＮＡ沉??默抑制子
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本文编号：2887842