网格轻链蛋白TaCLC1在调控小麦抗赤霉病中的功能分析
发布时间：2020-11-20 22:36
引起小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)的主要病原菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearwm,F.g)。作为一种世界性的麦类病害,每年都给小麦生产带来较大的损失。禾谷镰刀菌在侵染小麦的过程中不仅造成产量损失,而且产生如脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)等真菌毒素,影响小麦的品质及商品价值,严重危害人、畜健康。网格蛋白介导的内吞是细胞内外信号传导以及物质运输的主要方式,在生物体的生长发育过程中起到非常重要的作用。近年来,对植物网格蛋白的研究逐渐增多,发现植物网格蛋白能调控膜运输、盐胁迫、根瘤的形成、生长素信号及下胚轴的形成等,但是植物网格蛋白在抗真菌病害方面的研究较少,具体功能不清楚。实验室前期对感病材料济麦22(JM22)以及抗病材料济麦22-Fhb7(JM22-Fhb7)接种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearwm,F.g),进行转录组测序和生物信息学分析,发现网格蛋白等内吞途径相关基因的表达在接种前后差异较大,表明网格蛋白介导的内吞途径与赤霉病的发生很可能有密切关系。本研究,从济麦22-Fhb7中克隆得到了网格轻链蛋白基因TaCLC1(GenBank No:KT345966),并且对其进行了功能分析。主要结果与结论如下:(1)利用同源克隆和生物信息学方法克隆获得TaCLC1基因的全长cDNA序列(GenBank:KT345966)。该基因全长1207 bp,包含一个936 bp开放阅读框,编码311个氨基酸,分子量约32.9KDa。TaCLC1为单拷贝基因,位于小麦7BL染色体上;而且TaCLC1与大麦、玉米以及高粱中的网格轻链蛋白同源性较高。将TaCLC1::GFP融合蛋白在烟草表皮细胞中瞬时表达,利用双光子显微镜观察到,该融合蛋白定位于细胞质与细胞膜中。(2)qRT-PCR结果表明,TaCLC1在根、茎、叶和穗部均有表达,并且在叶片中的表达量最高;同时该基因的转录受到水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等多种激素及禾谷镰刀菌的诱导表达。(3)利用大麦条纹花叶病毒(Barely Stripe Mosaic Virus,BSMV)介导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技术,在小麦叶部进行了赤霉病的抗性鉴定,结果显示,BSMV::TaCLC1植株中腐生斑的面积明显比对照植株和BSMV::00植株中腐生斑面积大,同时禾谷镰刀菌的相对数量也较多,说明TaCLC1在小麦中能够抑制赤霉菌的生长。(4)利用转基因技术获得烟草以及拟南芥TaCLC1过表达株系。将禾谷镰刀菌接种到野生型拟南芥和过表达TaCLC1基因拟南芥的叶片上,5d后,统计各个株系的发病情况发现,野生型拟南芥叶片病斑面积小于25%的叶片数量占总数的18%,转基因拟南芥叶片上病斑面积小于25%的叶片占75%,转基因株系中大于75%的叶片数量占20%;同时发现野生型拟南芥中禾谷镰刀菌的相对数量为转基因的2倍左右。将禾谷镰刀菌接种到野生型烟草与转基因烟草的叶片上,发现野生型烟草叶片上有明显的较大病斑,而转基因烟草叶片上仅有个别的轻微病斑,且病原菌在转基因烟草叶片中菌丝的生长量要明显少于野生型烟草。上述结果说明,TaCLC1在调控小麦抗赤霉病中发挥着重要的功能。(5)检测TaCLC1基因的沉默小麦植株中水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)合成关键基因TaPAL、TaOPR的表达量发现,与对照相比,接种禾谷镰刀菌后沉默株系中TaPAL、TaOPR的表达量上调程度低于野生型。检测转基因烟草和拟南芥中病程相关蛋白基因的转录水平,发现过表达TaCLC1植株中PR1、PR2和PR3、PR5的转录水平明显高于WT。上述结果表明,TaCLC1有可能通过促进病程相关蛋白基因的表达抵御病原菌侵染。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.121.45
【部分图文】：
图 3-4 TaCLC1-GFP 融合蛋白在烟草表皮中的亚细胞定位Fig. 3-4 Subcellular localization of TaCLC1-GFP fusion protein in tobacco epidermis1 基因的表达模式分析1 基因在禾谷镰刀菌处理条件下的表达模式分析一心期小麦幼苗，对小麦幼苗的心叶进行注射禾谷镰刀菌的游动孢子3h，6h，12h，24h，36h 和 48h 取接种叶片，提取 RNA，反转录成物 qTaCLC1-5/3，用 qRT-PCR 检测 TaCLC1 基因转录水平，发现，与谷镰刀菌 1h 后，TaCLC1 基因的转录水平开始上升，到 6h 达到高之后又继续上升至 36h 到达顶峰，48h 又回落（图 3-5）。在 0-6h 内 MOCK（用于回溶禾谷镰刀菌游动孢子的无菌水）处理的情况下，水平都出现上升的趋势，出现这种现象的原因有可能为目的基因受损禾谷镰刀菌处理 24h 后，TaCLC1 基因的表达重新上调，可能是由于
图 3-5 小麦 TaCLC1 基因对禾谷镰刀菌的响应表达分析Fig. 3-5 Response Analysis of Wheat TaCLC1 Gene to Fusarium graminearum1 基因在不同植物激素诱导处理条件下的表达模式分析JA 途径在植物抗病信号转导通路中起着重要的调控作用，并且已SA、MeJA 能够提高小麦对赤霉病的抗性。为了明确 TaCLC1 是否，我们取一叶一心期小麦，分别进行喷施 2mM/L SA、0.5 mM/L Me24h，36h 和 48h 取心叶叶片，每个时间点取三棵植株，用 qRT-P的转录水平。发现，在喷施 SA 12h 后，TaCLC1 基因的转录水平开，之后又回落，呈现抛物线特征（图 3-6A）。而喷施 MeJA 后， 24h 达到高峰，之后又回落，同样呈现抛物线特征（图 3-6B），说明 SA、MeJA 处理的诱导表达。 B
图 3-7 TaCLC1 基因在小麦中组织特异性表达分析Fig. 3-7 Tissue-specific expression analysis of TaCLC1 gene in wheS 沉默小麦 TaCLC1 后抗赤霉病分析连接原理，设计特异性接头引物，扩增目的基因片的基因与 γ 载体，将酶切处理后的目的基因及线taclc1 已经成功连接（图 3-8）。将 α、β、γ/γ-tac含有 α、β 和 γ 组分的农杆菌液按照 1:1:1 的比例混烟展开叶，进行病毒的扩繁，9d 后提取上部叶片测证明病毒在本生烟中扩繁成功（图 3-9）。利用大技术（BSMV-VIGS）对 TaCLC1 进行基因沉默（汁液摩擦接种一叶一心期小麦叶片，用含有 α、β为 BSMV::00，用 α、β 和 γ-taclc1 病毒汁液摩擦18d 后检测接种叶片上部第一片叶的转录水平。经
【参考文献】
本文编号：2892096
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.121.45
【部分图文】：
图 3-4 TaCLC1-GFP 融合蛋白在烟草表皮中的亚细胞定位Fig. 3-4 Subcellular localization of TaCLC1-GFP fusion protein in tobacco epidermis1 基因的表达模式分析1 基因在禾谷镰刀菌处理条件下的表达模式分析一心期小麦幼苗，对小麦幼苗的心叶进行注射禾谷镰刀菌的游动孢子3h，6h，12h，24h，36h 和 48h 取接种叶片，提取 RNA，反转录成物 qTaCLC1-5/3，用 qRT-PCR 检测 TaCLC1 基因转录水平，发现，与谷镰刀菌 1h 后，TaCLC1 基因的转录水平开始上升，到 6h 达到高之后又继续上升至 36h 到达顶峰，48h 又回落（图 3-5）。在 0-6h 内 MOCK（用于回溶禾谷镰刀菌游动孢子的无菌水）处理的情况下，水平都出现上升的趋势，出现这种现象的原因有可能为目的基因受损禾谷镰刀菌处理 24h 后，TaCLC1 基因的表达重新上调，可能是由于
图 3-5 小麦 TaCLC1 基因对禾谷镰刀菌的响应表达分析Fig. 3-5 Response Analysis of Wheat TaCLC1 Gene to Fusarium graminearum1 基因在不同植物激素诱导处理条件下的表达模式分析JA 途径在植物抗病信号转导通路中起着重要的调控作用，并且已SA、MeJA 能够提高小麦对赤霉病的抗性。为了明确 TaCLC1 是否，我们取一叶一心期小麦，分别进行喷施 2mM/L SA、0.5 mM/L Me24h，36h 和 48h 取心叶叶片，每个时间点取三棵植株，用 qRT-P的转录水平。发现，在喷施 SA 12h 后，TaCLC1 基因的转录水平开，之后又回落，呈现抛物线特征（图 3-6A）。而喷施 MeJA 后， 24h 达到高峰，之后又回落，同样呈现抛物线特征（图 3-6B），说明 SA、MeJA 处理的诱导表达。 B
图 3-7 TaCLC1 基因在小麦中组织特异性表达分析Fig. 3-7 Tissue-specific expression analysis of TaCLC1 gene in wheS 沉默小麦 TaCLC1 后抗赤霉病分析连接原理，设计特异性接头引物，扩增目的基因片的基因与 γ 载体，将酶切处理后的目的基因及线taclc1 已经成功连接（图 3-8）。将 α、β、γ/γ-tac含有 α、β 和 γ 组分的农杆菌液按照 1:1:1 的比例混烟展开叶，进行病毒的扩繁，9d 后提取上部叶片测证明病毒在本生烟中扩繁成功（图 3-9）。利用大技术（BSMV-VIGS）对 TaCLC1 进行基因沉默（汁液摩擦接种一叶一心期小麦叶片，用含有 α、β为 BSMV::00，用 α、β 和 γ-taclc1 病毒汁液摩擦18d 后检测接种叶片上部第一片叶的转录水平。经
【参考文献】
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3 华文爱;邢广余;;小麦赤霉病的危害识别与发生规律[J];农技服务;2009年08期
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本文编号：2892096
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