柑橘黄龙病菌408和PAP蛋白基因的克隆及表达应用
发布时间：2021-02-09 02:29
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）严重威胁世界柑橘产业的发展,对其造成巨大经济损失。HLB具有一定的潜伏期,从病原菌感染到引起黄化症状需要一定的时间,因此建立一种高效、灵敏、快速的检测方法,应用于柑橘产业的健康发展非常必要。细菌分泌蛋白是细菌产生的一种效应因子,在细菌的致病过程中起重要作用。本研究从柑橘黄龙病菌亚洲株系基因组中分析了病原菌分泌蛋白系统及相关分泌蛋白的10个基因,通过荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）方法,筛选获得RNA含量较高的2个蛋白基因。开展了分泌蛋白基因表达量和亚细胞定位研究,为研究该蛋白参与的HLB致病机理奠定基础;同时对这2个分泌蛋白基因进行原核表达,免疫小鼠制备了特异抗血清,为408和PAP蛋白功能研究和开发HLB的蛋白检测产品提供基础。具体结果如下:（1）以海南琼中、琼海感染HLB的绿橙为材料,提取总DNA和RNA,制备DNA和cDNA。根据柑橘黄龙病菌亚洲株系基因组中分析的病原菌分泌蛋白系统及相关分泌蛋白的6个基因,设计荧光定量PCR（RT-qPCR）引物,对HLB样品的6个基因mRNA表达量进行定量检测。结果表明:琼海和...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３绿橙样品总ＲＡＮ的提取??
图２绿橙样品总ＤＮＡ的提ｈｅ?ｅｘｔｒａｃｔ?ｔｏｔａｌ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｇｒｅｒ；?１：琼海绿橙总ＤＮＡ提取；２ｌ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｇｒｅｅｎ?Ｏｒａｎｇｅ?ｏｆ?ＱＯｒａｎｅ?ｏｆｉｏｎｚｈｏｎ
３．?１．２高分泌蛋白基因４促和以／７的定量筛选??荧光定量ＰＣＲ结果分析表明琼海和琼中６种分泌蛋白基因和内参基因１６ＳｒＲＮＡ??的扩增曲线（图４）均为单峰，表明扩增片段唯一，没有非特异性扩增产生。ｑＲＴ－ＰＣＲ??的扩增结果表明，６个基因均扩增较弱，其中４洲和烈／３基因有扩增曲线，Ｃｔ值在??１５？３５之间，其余基因没有明显的扩增曲线或扩增较弱，Ｃｔ超过３５?（Ｃｔ?＞３５，表示??很低的扩增量或扩增不特异）。进－步的分析表明，在琼海样品中仰基因的表达水??平比别户基因表达水平高２．４３；在琼中样品中，４洲基因的表达水平比烈户基因表??达水平高９．４５比琼海样品中４财基因的表达水平还要高（图５）。综合ＲＴ－ｑＰＣＲ的结??果分析，我们从６种柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因中筛选出２个相对含量较高的基因，??即祁＜９和州尸。??Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ?Ｃｕｒｖｅ??６１９?－ｊ?Ａ??ｅ｜?１??－８１?Ｔ?ｒ——Ｔ?—Ｔ?！?Ｔ?Ｔ?—Ｔ?－?ｒ?－?Ｔ－?－Ｔ－—Ｔ?ｒ?￣Ｔ＇一Ｉ?１?１?Ｔ?Ｔ?１??５５?５７?５９?６１?６３?６５?６７?６９?７１?７３?７５?７７?７９?８１?８３?８５?８７?８９?９１?９３?９５??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?（Ｘ／）??图４?６种分泌蛋白基因和内参１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因焚光定
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚洲柑橘木虱的生物学研究进展及防治[J]. 余继华,黄振东,张敏荣,张宁,李萍,卢璐,杨晓. 植物检疫. 2018(05)
[2]柑橘黄龙病检测技术研究进展[J]. 万爽,肖婉钰,黄江华. 仲恺农业工程学院学报. 2018(01)
[3]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[4]柑橘黄龙病研究概况[J]. 陈凯男,李充璧. 浙江农业科学. 2015(07)
[5]细菌Ⅶ型分泌系统的研究进展[J]. 于俊媛,姜北,张骁鹏,黎庶,胡晓梅. 微生物与感染. 2015(02)
[6]血清学方法在几种猪病毒抗体检测中的应用进展[J]. 陈亮,于克江,张鹏宇,王志强,李洪彬,刘力威. 农业开发与装备. 2015(02)
[7]柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立及应用[J]. 黄丽,苏华楠,唐科志,黄爱军,周常勇,李中安. 果树学报. 2012(06)
[8]几种微生物表达系统的比较[J]. 陈明,陈文静. 安徽农学通报(上半月刊). 2011(03)
[9]动物抗血清及其制备技术要点与应用进展[J]. 王占伟,邵国青,陈笑娟. 江西农业学报. 2009(07)
[10]柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法[J]. 莫元妹. 现代农业科学. 2009(05)
硕士论文
[1]洋葱果胶甲酯酶基因AcPME的克隆、原核表达及亚细胞定位[D]. 孙亚玲.山东农业大学 2017
[2]柑橘黄龙病PCR检测引物比较及其外膜蛋白抗体的研制[D]. 高玉霞.赣南师范学院 2015
[3]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的表达纯化及两种重要病原的分子检测[D]. 侯卫真.华中农业大学 2014
本文编号：3024896
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３绿橙样品总ＲＡＮ的提取??
图２绿橙样品总ＤＮＡ的提ｈｅ?ｅｘｔｒａｃｔ?ｔｏｔａｌ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｇｒｅｒ；?１：琼海绿橙总ＤＮＡ提取；２ｌ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｇｒｅｅｎ?Ｏｒａｎｇｅ?ｏｆ?ＱＯｒａｎｅ?ｏｆｉｏｎｚｈｏｎ
３．?１．２高分泌蛋白基因４促和以／７的定量筛选??荧光定量ＰＣＲ结果分析表明琼海和琼中６种分泌蛋白基因和内参基因１６ＳｒＲＮＡ??的扩增曲线（图４）均为单峰，表明扩增片段唯一，没有非特异性扩增产生。ｑＲＴ－ＰＣＲ??的扩增结果表明，６个基因均扩增较弱，其中４洲和烈／３基因有扩增曲线，Ｃｔ值在??１５？３５之间，其余基因没有明显的扩增曲线或扩增较弱，Ｃｔ超过３５?（Ｃｔ?＞３５，表示??很低的扩增量或扩增不特异）。进－步的分析表明，在琼海样品中仰基因的表达水??平比别户基因表达水平高２．４３；在琼中样品中，４洲基因的表达水平比烈户基因表??达水平高９．４５比琼海样品中４财基因的表达水平还要高（图５）。综合ＲＴ－ｑＰＣＲ的结??果分析，我们从６种柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因中筛选出２个相对含量较高的基因，??即祁＜９和州尸。??Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ?Ｃｕｒｖｅ??６１９?－ｊ?Ａ??ｅ｜?１??－８１?Ｔ?ｒ——Ｔ?—Ｔ?！?Ｔ?Ｔ?—Ｔ?－?ｒ?－?Ｔ－?－Ｔ－—Ｔ?ｒ?￣Ｔ＇一Ｉ?１?１?Ｔ?Ｔ?１??５５?５７?５９?６１?６３?６５?６７?６９?７１?７３?７５?７７?７９?８１?８３?８５?８７?８９?９１?９３?９５??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?（Ｘ／）??图４?６种分泌蛋白基因和内参１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因焚光定
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚洲柑橘木虱的生物学研究进展及防治[J]. 余继华,黄振东,张敏荣,张宁,李萍,卢璐,杨晓. 植物检疫. 2018(05)
[2]柑橘黄龙病检测技术研究进展[J]. 万爽,肖婉钰,黄江华. 仲恺农业工程学院学报. 2018(01)
[3]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[4]柑橘黄龙病研究概况[J]. 陈凯男,李充璧. 浙江农业科学. 2015(07)
[5]细菌Ⅶ型分泌系统的研究进展[J]. 于俊媛,姜北,张骁鹏,黎庶,胡晓梅. 微生物与感染. 2015(02)
[6]血清学方法在几种猪病毒抗体检测中的应用进展[J]. 陈亮,于克江,张鹏宇,王志强,李洪彬,刘力威. 农业开发与装备. 2015(02)
[7]柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立及应用[J]. 黄丽,苏华楠,唐科志,黄爱军,周常勇,李中安. 果树学报. 2012(06)
[8]几种微生物表达系统的比较[J]. 陈明,陈文静. 安徽农学通报(上半月刊). 2011(03)
[9]动物抗血清及其制备技术要点与应用进展[J]. 王占伟,邵国青,陈笑娟. 江西农业学报. 2009(07)
[10]柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法[J]. 莫元妹. 现代农业科学. 2009(05)
硕士论文
[1]洋葱果胶甲酯酶基因AcPME的克隆、原核表达及亚细胞定位[D]. 孙亚玲.山东农业大学 2017
[2]柑橘黄龙病PCR检测引物比较及其外膜蛋白抗体的研制[D]. 高玉霞.赣南师范学院 2015
[3]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的表达纯化及两种重要病原的分子检测[D]. 侯卫真.华中农业大学 2014
本文编号：3024896
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