梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

发布时间：2021-02-23 00:46

　　【目的】将叠氮溴化丙啶（PMA）与实时荧光定量PCR技术（qPCR）相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌（Erwinia amylovora）质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10⁸CFU·mL^-1、PMA浓度为25μmol·L^-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%～100%时(浓度为6.0×10⁷～6.0×10⁸CFU·mL^-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系（R... 

【文章来源】：果树学报. 2020,37(09)北大核心

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 供试材料
        1.1.1 供试菌株和培养基
        1.1.2 供试植物
        1.1.3 主要试剂和设备
    1.2 梨火疫病菌死菌和活菌菌悬液的制备
    1.3 梨火疫病菌q PCR检测引物及特异性验证
    1.4 PMA处理反应条件的优化
        1.4.1 PMA浓度的优化
        1.4.2 PMA曝光时间的优化
    1.5 PMA-q PCR对E.amylovora死活菌混合液的检测
    1.6 PMA-q PCR标准曲线的建立和灵敏度检测
    1.7 果树枝条病样的PMA-q PCR检测
    1.8 数据分析
2 结果与分析
    2.1 利用梨火疫病菌q PCR检测引物对Ea P29F1/Ea P29R1的特异性验证
    2.2 PMA处理反应条件的优化
        2.2.1 抑制E.amylovora死菌扩增的最佳PMA浓度
        2.2.2 PMA曝光时间的的优化
    2.3 PMA-q PCR检测E.amylovora的标准曲线及灵敏度
    2.4 PMA-q PCR对E.a死活菌混合液的检测
    2.5 果树枝条样品中E.a的PMA-q PCR检测
3 讨论



本文编号：3046779