添加扩增内标的逆转录重组酶聚合酶扩增技术检测三种大豆病毒
发布时间：2021-03-21 20:08
假阴性结果是影响核酸检测结果的主要因素之一。扩增内标（internal amplification control,IAC）在监控PCR过程中假阴性结果发挥着重要作用。为探索扩增内标在逆转录重组酶聚合酶常温扩增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA）检测过程中的应用,解决RT-RPA检测过程中的假阴性问题,本研究通过复合引物法人工构建了扩增内标,并应用于大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus, SMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）及南方菜豆花叶病毒（Southern bean mosaic virus, SBMV）三种大豆病毒RT-RPA检测过程。实验结果显示,所建立的方法能够实现目的基因特异性扩增的同时指示假阴性结果。灵敏度试验结果表明,当50μL反应体系中扩增内标添加量为1.83×104copies时,该体系对SMV及BPMV的检测灵敏度为0.05 ng;扩增内标添加量为1.83×103copies时,该体系对SBMV的检测灵...
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(12)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
扩增内标构建示意图
图5 BPMV的IAC-RT-RPA检测灵敏度评价由于扩增内标的两端分别连接有目标检测引物，扩增内标与目的片段可利用同一对引物在同一RPA反应中同时扩增，二者之间会存在竞争，扩增内标浓度过低则无法指示假阴性现象，过高则会影响检测体系的灵敏度(丁钿等,2019;李伟等,2019)。本研究结果表明，不同靶标扩增内标添加量略有区别，因此，需针对不同靶标分别进行优化。
结果如图4所示。当50μL反应体系中扩增内标添加量为1.83×103copies时，IAC-RT-RPA方法的检测灵敏度为10-2稀释度，即0.5 ng，且当模板浓度为10-1到10-7稀释度时，出现了337 bp的内标扩增片段，说明不存在反应假阴性；而当扩增内标添加量为1.83×104copies时，IAC-RT-RPA方法的检测灵敏度为10-3稀释度，即0.05 ng，且当模板浓度为10-3到10-7稀释度时，出现了337 bp的内标扩增片段，说明不存在反应假阴性。因此，本研究得出当扩增内标添加量为1.83×104copies时，检测灵敏度为10-3稀释度，即0.05 ng，可用于大豆花叶病毒RT-RPA检测过程中的假阴性结果监测，提高结果准确性。2.3.3 菜豆荚斑驳病毒评价
【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增技术在快速病原菌检测中的价值[J]. 陈艳玲. 实用检验医师杂志. 2019(03)
[2]马铃薯斑纹片病菌IAC-PCR检测方法[J]. 丁钿,魏霜,李新浩,章柱,余辛,胡学难,赵文军. 植物检疫. 2019(05)
[3]添加扩增内标的重组酶聚合酶扩增技术（RPA-IAC）检测创伤弧菌[J]. 李伟,庄濠宇,温尔英,张峥嵘,黄琦容,周广彪. 检验检疫学刊. 2019(03)
[4]含内标的多重实时PCR法同时检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌[J]. 申进玲,赵丽娜,蒋原,韩伟,袁辰刚. 食品安全质量检测学报. 2019(07)
[5]重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用[J]. 周莹,杨丽梅,刘梅,黄金宝. 中国蔬菜. 2019(01)
[6]一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增（RT-RPA）技术检测菜豆荚斑驳病毒[J]. 张永江,魏霜,袁俊杰,乾义柯,李桂芬,魏梅生. 江苏农业科学. 2018(21)
[7]2017年山东口岸进口大豆中有害生物截获分析[J]. 李林杰,王凯,高尧华,许美玲,刘培海. 大豆科学. 2018(03)
[8]一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增技术（RT-RPA）检测大豆花叶病毒[J]. 袁俊杰,魏霜,龙阳,马新华,杨卓瑜,卢乃会,乾义柯,魏梅生,李桂芬,张永江. 检验检疫学刊. 2018(02)
[9]南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立[J]. 魏霜,袁俊杰,李桂芬,乾义柯,魏梅生,冯黎霞,胡学难,何日荣,武目涛,张永江. 植物检疫. 2018(01)
[10]等温核酸扩增技术进展[J]. 梁海燕,刘文鑫,杨志刚. 中国医学创新. 2017(16)
硕士论文
[1]含扩增内标的PCR技术在犬、猫5种病毒检测中的应用研究[D]. 肖霞.南京农业大学 2017
本文编号：3093467
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(12)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
扩增内标构建示意图
图5 BPMV的IAC-RT-RPA检测灵敏度评价由于扩增内标的两端分别连接有目标检测引物，扩增内标与目的片段可利用同一对引物在同一RPA反应中同时扩增，二者之间会存在竞争，扩增内标浓度过低则无法指示假阴性现象，过高则会影响检测体系的灵敏度(丁钿等,2019;李伟等,2019)。本研究结果表明，不同靶标扩增内标添加量略有区别，因此，需针对不同靶标分别进行优化。
结果如图4所示。当50μL反应体系中扩增内标添加量为1.83×103copies时，IAC-RT-RPA方法的检测灵敏度为10-2稀释度，即0.5 ng，且当模板浓度为10-1到10-7稀释度时，出现了337 bp的内标扩增片段，说明不存在反应假阴性；而当扩增内标添加量为1.83×104copies时，IAC-RT-RPA方法的检测灵敏度为10-3稀释度，即0.05 ng，且当模板浓度为10-3到10-7稀释度时，出现了337 bp的内标扩增片段，说明不存在反应假阴性。因此，本研究得出当扩增内标添加量为1.83×104copies时，检测灵敏度为10-3稀释度，即0.05 ng，可用于大豆花叶病毒RT-RPA检测过程中的假阴性结果监测，提高结果准确性。2.3.3 菜豆荚斑驳病毒评价
【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增技术在快速病原菌检测中的价值[J]. 陈艳玲. 实用检验医师杂志. 2019(03)
[2]马铃薯斑纹片病菌IAC-PCR检测方法[J]. 丁钿,魏霜,李新浩,章柱,余辛,胡学难,赵文军. 植物检疫. 2019(05)
[3]添加扩增内标的重组酶聚合酶扩增技术（RPA-IAC）检测创伤弧菌[J]. 李伟,庄濠宇,温尔英,张峥嵘,黄琦容,周广彪. 检验检疫学刊. 2019(03)
[4]含内标的多重实时PCR法同时检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌[J]. 申进玲,赵丽娜,蒋原,韩伟,袁辰刚. 食品安全质量检测学报. 2019(07)
[5]重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用[J]. 周莹,杨丽梅,刘梅,黄金宝. 中国蔬菜. 2019(01)
[6]一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增（RT-RPA）技术检测菜豆荚斑驳病毒[J]. 张永江,魏霜,袁俊杰,乾义柯,李桂芬,魏梅生. 江苏农业科学. 2018(21)
[7]2017年山东口岸进口大豆中有害生物截获分析[J]. 李林杰,王凯,高尧华,许美玲,刘培海. 大豆科学. 2018(03)
[8]一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增技术（RT-RPA）检测大豆花叶病毒[J]. 袁俊杰,魏霜,龙阳,马新华,杨卓瑜,卢乃会,乾义柯,魏梅生,李桂芬,张永江. 检验检疫学刊. 2018(02)
[9]南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立[J]. 魏霜,袁俊杰,李桂芬,乾义柯,魏梅生,冯黎霞,胡学难,何日荣,武目涛,张永江. 植物检疫. 2018(01)
[10]等温核酸扩增技术进展[J]. 梁海燕,刘文鑫,杨志刚. 中国医学创新. 2017(16)
硕士论文
[1]含扩增内标的PCR技术在犬、猫5种病毒检测中的应用研究[D]. 肖霞.南京农业大学 2017
本文编号：3093467
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3093467.html
