诱导茶树抗茶小绿叶蝉挥发物筛选体系的建立及反式—橙花叔醇诱抗机制初探
发布时间：2021-03-31 10:01
茶树（Camellia sinensis）是亚洲重要的经济木本作物。茶小绿叶蝉是茶园首要害虫,目前缺乏高效无害化的防治技术,防治主要依赖化学农药。受害植株释放的某些挥发物可作为一种挥发性信号,引发临近未受害植株的抗虫反应。因此,筛选出具有高效诱抗功能的挥发物,可为茶小绿叶蝉的防控提供新思路。本研究以茶树12-氧-植物二烯酸还原酶基因CsOPR3作为与茶树抗茶小绿叶蝉的分子标记基因,并基于该基因在拟南芥上建立了一种诱导茶树抗茶小绿叶蝉挥发物的快速筛选体系。利用该体系和生物测定,明确了候选物质（E）-橙花叔醇的诱抗活性。并进一步对其诱抗的分子机制进行了初步研究。研究结果主要如下:1.表达分析结果表明,机械损伤、茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）和茶小绿叶蝉处理均能提高CsOPR3的蛋白水平;茶小绿叶蝉的取食显著提高了CsOPR3基因的转录水平。克隆了茶树CsOPR3基因,开放阅读框1197 bp。构建35S::CsOPR3过表达载体,插入opr3突变体中获得两个T2代纯合品系。机械损伤处理后,过表达的CsOPR3基因补充了opr3突变体中的JA水平。同时,外源JA处理显著降低茶枝上...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
恢昃??庠窜岳蛩岽?恚?硗庖恢瓴蛔龃?怼Ｏ虿Ａ?恐惺头?5只成年雌性茶小绿叶蝉。茶小绿叶蝉释放后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h记录每个茶枝上的虫口数量。72h后，去除装置中茶小绿叶蝉，并记录每株植物上的产卵数量。每个处理重复六次。2.2结果与分析2.2.1机械损伤、JA和茶小绿叶蝉取食处理提高CsOPR3的蛋白水平为了更好地解析茶树CsOPR3的功能，我们检测了机械损伤、JA处理和茶小绿叶蝉取食后茶树中CsOPR3积累水平。结果表明CsOPR3蛋白在损伤叶中积累，并在3h达到峰值，随后表达下降，在24h时降到很低的水平（图2-1a）；JA处理提高了CsOPR3的积累，并在之后升高保持至24h（图2-1a）。这一结果与前期研究报道结果CsOPR3基因转录结果相一致（XINetal.,2017）。此外，茶小绿叶蝉的取食增强了CsOPR3的蛋白水平和转录水平，茶小绿叶蝉取食诱导茶树CsOPR3基因表达量从3h开始升高，直至24h时表达量处于最大值（图2-1b）。图2-1不同处理时茶叶中CsOPR3的蛋白水平和转录水平。(a)机械伤害(W)、茉莉酸(JA)和茶小绿叶蝉(TLH)取食处理后茶叶中CsOPR3积累的Westernblot分析。(b)CsOPR3在茶小绿叶蝉侵染茶树叶片和对照中的相对表达水平（t检验，*P<0.05;**P<0.01）
PR3基因的功能，明确CsOPR3基因在茶树抗虫中的作用，构建CsOPR3基因的过表达载体，利用设计的引物，从茶树cDNA中克隆到CsOPR3基因的1197bp的ORF区域。利用ClaI和KpnI两种限制性核酸内切酶，对pCAMBIA1301与PCR产物双酶切，产物割胶回收后用T4-DNA连接酶在4℃环境中连接，以此获得过表达载体。2.2.3CsOPR3过表达拟南芥植株的获得及验证为了验证CsOPR3基因是否参与茶树中JA的生物合成，将CsOPR3基因在拟南芥opr3突变体中过量表达，获得oeL1和oeL2两个品系。20天大小的WT，opr3，oeL1和oeL2品系拟南生长表型相一致，并无差别（图2-2a）。Southern印迹分析表明oeL1具有单个插入，而oeL2具有双拷贝（图2-2b）。图2-2拟南芥生长表型和Southern印迹杂交分析。(a)20天大小的WT,opr3,oeL1和oeL2品系拟南芥的生长表型。(b)Southernblot分析两个独立转基因系（oeL1和oeL2）的转基因拷贝数Fig.2-2GrowthphenotypeandSouthernblotanalysisofArabidopsis.(c)GrowthphenotypesofWT,opr3,oeL1andoeL2linesin20-day-oldplants.(b)Southernblotanalysisoftransgenecopiesoftwoindependenttransgeniclines(oeL1andoeL2).2.2.4CsOPR3基因可能参与茶树JA的生物合成通过机械损伤处理WT，opr3，oeL1和oeL2品系拟南芥，检测JA含量结果如下图所示，与野生型拟南芥相比较，opr3突变体中JA含量较低；在过量表达CsOPR3基因的opr3突变体中，
【参考文献】：
期刊论文
[1]MYC2,MYC3,and MYC4 function additively in wounding-induced jasmonic acid biosynthesis and catabolism[J]. Cuiping Zhang,Yunting Lei,Chengkai Lu,Lei Wang,Jianqiang Wu. Journal of Integrative Plant Biology. 2020 (08)
[2]新中国成立70年来植物激素研究进展[J]. 黎家,李传友. 中国科学:生命科学. 2019(10)
[3]乙烯的生物合成与信号及其对种子萌发和休眠的调控[J]. 宋松泉,刘军,徐恒恒,张琪,黄荟,伍贤进. 作物学报. 2019(07)
[4]植物-植食性昆虫互作关系中早期信号事件研究进展[J]. 徐丽萍,李恒,娄永根. 植物保护学报. 2018(05)
[5]利用化学激发子防控作物害虫研究进展[J]. 胡宁宁,叶苗芬,娄永根. 植物保护学报. 2018(05)
[6]茶尺蠖为害提高邻近茶苗对茶尺蠖幼虫的防御能力[J]. 雷舒,李喜旺,孙晓玲,王志英,辛肇军. 茶叶科学. 2016(06)
[7]植物诱导抗虫性的调控机制及蛋白组学研究进展[J]. 张斌,刘洋,张玉贺,刘洁,高宝嘉. 河北林果研究. 2016(03)
[8]Language of plants: Where is the word?[J]. Maja impraga,Junji Takabayashi,Jarmo K.Holopainen. Journal of Integrative Plant Biology. 2016(04)
[9]虫害挥发物对邻近枣树直接防御反应的激发作用[J]. 范艳玲,李新岗,韩颖,张学武. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[10]水杨酸介导的植物系统获得抗性信号的传导途径[J]. 李占杰,师金鸽,杨铁钊. 中国农学通报. 2006(12)
博士论文
[1]植物对斑潜蝇防御的多层次研究[D]. 张苏芳.中国科学技术大学 2010
[2]三种茶树害虫诱导茶树挥发物的释放规律[D]. 蔡晓明.中国农业科学院 2009
硕士论文
[1]顺-3-己烯醇诱导茶树对茶尺蠖抗性的分子机制[D]. 戈林刚.山东农业大学 2018
本文编号：3111246
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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恢昃??庠窜岳蛩岽?恚?硗庖恢瓴蛔龃?怼Ｏ虿Ａ?恐惺头?5只成年雌性茶小绿叶蝉。茶小绿叶蝉释放后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h记录每个茶枝上的虫口数量。72h后，去除装置中茶小绿叶蝉，并记录每株植物上的产卵数量。每个处理重复六次。2.2结果与分析2.2.1机械损伤、JA和茶小绿叶蝉取食处理提高CsOPR3的蛋白水平为了更好地解析茶树CsOPR3的功能，我们检测了机械损伤、JA处理和茶小绿叶蝉取食后茶树中CsOPR3积累水平。结果表明CsOPR3蛋白在损伤叶中积累，并在3h达到峰值，随后表达下降，在24h时降到很低的水平（图2-1a）；JA处理提高了CsOPR3的积累，并在之后升高保持至24h（图2-1a）。这一结果与前期研究报道结果CsOPR3基因转录结果相一致（XINetal.,2017）。此外，茶小绿叶蝉的取食增强了CsOPR3的蛋白水平和转录水平，茶小绿叶蝉取食诱导茶树CsOPR3基因表达量从3h开始升高，直至24h时表达量处于最大值（图2-1b）。图2-1不同处理时茶叶中CsOPR3的蛋白水平和转录水平。(a)机械伤害(W)、茉莉酸(JA)和茶小绿叶蝉(TLH)取食处理后茶叶中CsOPR3积累的Westernblot分析。(b)CsOPR3在茶小绿叶蝉侵染茶树叶片和对照中的相对表达水平（t检验，*P<0.05;**P<0.01）
PR3基因的功能，明确CsOPR3基因在茶树抗虫中的作用，构建CsOPR3基因的过表达载体，利用设计的引物，从茶树cDNA中克隆到CsOPR3基因的1197bp的ORF区域。利用ClaI和KpnI两种限制性核酸内切酶，对pCAMBIA1301与PCR产物双酶切，产物割胶回收后用T4-DNA连接酶在4℃环境中连接，以此获得过表达载体。2.2.3CsOPR3过表达拟南芥植株的获得及验证为了验证CsOPR3基因是否参与茶树中JA的生物合成，将CsOPR3基因在拟南芥opr3突变体中过量表达，获得oeL1和oeL2两个品系。20天大小的WT，opr3，oeL1和oeL2品系拟南生长表型相一致，并无差别（图2-2a）。Southern印迹分析表明oeL1具有单个插入，而oeL2具有双拷贝（图2-2b）。图2-2拟南芥生长表型和Southern印迹杂交分析。(a)20天大小的WT,opr3,oeL1和oeL2品系拟南芥的生长表型。(b)Southernblot分析两个独立转基因系（oeL1和oeL2）的转基因拷贝数Fig.2-2GrowthphenotypeandSouthernblotanalysisofArabidopsis.(c)GrowthphenotypesofWT,opr3,oeL1andoeL2linesin20-day-oldplants.(b)Southernblotanalysisoftransgenecopiesoftwoindependenttransgeniclines(oeL1andoeL2).2.2.4CsOPR3基因可能参与茶树JA的生物合成通过机械损伤处理WT，opr3，oeL1和oeL2品系拟南芥，检测JA含量结果如下图所示，与野生型拟南芥相比较，opr3突变体中JA含量较低；在过量表达CsOPR3基因的opr3突变体中，
【参考文献】：
期刊论文
[1]MYC2,MYC3,and MYC4 function additively in wounding-induced jasmonic acid biosynthesis and catabolism[J]. Cuiping Zhang,Yunting Lei,Chengkai Lu,Lei Wang,Jianqiang Wu. Journal of Integrative Plant Biology. 2020 (08)
[2]新中国成立70年来植物激素研究进展[J]. 黎家,李传友. 中国科学:生命科学. 2019(10)
[3]乙烯的生物合成与信号及其对种子萌发和休眠的调控[J]. 宋松泉,刘军,徐恒恒,张琪,黄荟,伍贤进. 作物学报. 2019(07)
[4]植物-植食性昆虫互作关系中早期信号事件研究进展[J]. 徐丽萍,李恒,娄永根. 植物保护学报. 2018(05)
[5]利用化学激发子防控作物害虫研究进展[J]. 胡宁宁,叶苗芬,娄永根. 植物保护学报. 2018(05)
[6]茶尺蠖为害提高邻近茶苗对茶尺蠖幼虫的防御能力[J]. 雷舒,李喜旺,孙晓玲,王志英,辛肇军. 茶叶科学. 2016(06)
[7]植物诱导抗虫性的调控机制及蛋白组学研究进展[J]. 张斌,刘洋,张玉贺,刘洁,高宝嘉. 河北林果研究. 2016(03)
[8]Language of plants: Where is the word?[J]. Maja impraga,Junji Takabayashi,Jarmo K.Holopainen. Journal of Integrative Plant Biology. 2016(04)
[9]虫害挥发物对邻近枣树直接防御反应的激发作用[J]. 范艳玲,李新岗,韩颖,张学武. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[10]水杨酸介导的植物系统获得抗性信号的传导途径[J]. 李占杰,师金鸽,杨铁钊. 中国农学通报. 2006(12)
博士论文
[1]植物对斑潜蝇防御的多层次研究[D]. 张苏芳.中国科学技术大学 2010
[2]三种茶树害虫诱导茶树挥发物的释放规律[D]. 蔡晓明.中国农业科学院 2009
硕士论文
[1]顺-3-己烯醇诱导茶树对茶尺蠖抗性的分子机制[D]. 戈林刚.山东农业大学 2018
本文编号：3111246
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