小麦白粉菌无毒基因AvrPm2和产孢相关基因STPK2的克隆与功能分析
发布时间：2021-04-28 04:13
在我国,白粉病是小麦和大麦等禾谷类作物上的重要病害。引起小麦白粉病的病原菌是禾布氏白粉菌小麦专化型（Blumeriagraminis f.sp.tritici,Bgt）。它是一种专性寄生真菌,在我国麦区分布广泛,可远距离传播,对不同的小麦品种具有明显的小种分化,且毒性变异快。培育和种植抗病品种是防治白粉病最经济、有效和环保的措施之一。由主效抗病基因介导的小种专化抗病性在白粉病抗病育种中得到了广泛的应用。然而,寄主垂直抗性给病原菌施加了选择压力,使得病原菌群体中毒性小种出现和不断积累,最终导致品种抗性被克服。针对上述问题,一方面需要对病原菌群体致病型进行监测,进一步克隆无毒基因,了解毒性变异的分子机制,以便更加有效地利用抗病基因。另一方面需要对品种抗性进行改良,加快持久抗病品种的培育进程。本研究拟开展如下两方面的工作。1)对我国白粉菌群体致病型进行多样性分析,筛选出具有不同致病谱的菌株,采用比较基因组学研究方法鉴定无毒基因,并揭示其变异规律。2)采用转录组学分析方法对白粉菌无性产孢相关基因进行研究,筛选出控制产孢的关键基因,并利用基因沉默技术明确其功能,为RNAi介导的持久抗病品种的培育...
【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：157 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
本研究的创新点
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 小麦白粉病的危害
1.2 小麦白粉菌的主要特征及生活史
1.3 小麦白粉菌的小种分化
1.4 禾谷类白粉菌无毒基因研究进展
1.4.1 无毒基因与寄主R基因的识别模型
1.4.2 无毒基因与寄主R基因的互作类型
1.4.3 无毒基因的变异机制
1.4.4 禾谷类白粉菌无毒基因
1.5 禾谷类白粉菌产孢相关基因研究进展
1.5.1 BrlA调控途径
1.5.2 G蛋白介导的信号转导途径
1.5.3 钙离子(Ca~(2+)),MAPK( mitogen-activated protein kinase)和活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)介导的信号通路
1.5.4 不同真菌产孢过程涉及的其他调控因子
1.5.5 白粉菌产孢相关基因研究进展
1.6 本研究的目的和意义
第二章 我国小麦白粉菌致病型多样性分析
2.1 材料与方法
2.1.1 鉴别寄主
2.1.2 白粉菌标样的采集
2.1.3 单孢子菌株的分离、扩繁及保存
2.1.4 苗期致病性测定
2.1.5 侵染型的调查和致病型的表示
2.1.6 毒性复杂度及毒性频率的计算
2.1.7 Pm基因有效性分析
2.1.8 菌株群体内及群体间多样性指数的计算
2.1.9 成对无毒基因位点之间的关联分析
2.2 结果与分析
2.2.1 毒性频率
2.2.2 致病型和毒性复杂度
2.2.3 群体多样性和遗传距离
2.2.4 无毒基因位点之间的关联分析
2.3 结论与讨论
第三章 小麦白粉菌AvrPm2候选基因的克隆
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株的来源及致病型
3.1.2 基因组DNA样品的制备和提取
3.1.3 RNA样品的制备和提取
3.1.4 基因组文库的构建和测序
3.1.5 转录组文库的构建及测序
3.1.6 基因组大小的估算和组装
3.1.7 基因预测
3.1.8 基因功能注释
3.1.9 SNP、InDel及PAV的鉴定
3.1.10 Effector基因的预测
3.1.11 Effector基因的变异及表达特征分析
3.1.12 表型与基因型数据的关联分析
3.1.13 候选无毒基因的PCR确认
3.2 结果与分析
3.2.1 100个菌株的地理来源和致病型多样性
3.2.2 基因组序列的组装和质量评估
3.2.3 重复序列和非编码RNA的预测
3.2.4 基因预测
3.2.5 基因注释
3.2.6 Effector基因的预测及表达谱分析
3.2.7 99个菌株在基因组水平上的变异
3.2.8 AvrPm2候选基因的鉴定
3.2.9 AvrPm2候选基因的PCR验证
3.2.10 AvrPm2候选基因的序列,注释及表达特征分析
3.3 结论与讨论
第四章 小麦白粉菌产孢相关差异表达基因分析
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株的培养和接种
4.1.2 转录组测序组织样的准备和RNA的提取
4.1.3 总RNA的检测和文库的构建及测序
4.1.4 序列质量的评估
4.1.5 基因差异表达分析
4.1.6 差异表达基因的注释
4.1.7 定量反转录PCR分析(quantitative reverse-transcriptase PCR, qRT-PCR)
4.1.8 参与基础代谢的基因的鉴定
4.1.9 参与信号通路和转录调控基因的鉴定
4.1.10 B.graminis特有基因的鉴定
4.1.11 EGTA和TFP的处理
4.1.12 染色和组织学观察
4.1.13 统计分析
4.2 结果与分析
4.2.1 小麦白粉菌的无性发育过程
4.2.2 高质量RNA-seq数据的获得
4.2.3 产孢阶段的基因差异表达分析
4.2.4 参与碳水化合物代谢,能量代谢和不饱和脂肪酸代谢的差异表达基因分析
4.2.5 抗氧化系统的激活及H_2O_2在分生孢子梗中的积累
4.2.6 白粉菌产孢过程中参与主要信号通路和转录调控的差异表达基因分析
4.2.7 Ca~(2+)螯合剂EGTA和钙调蛋白抑制剂TFP对白粉菌产孢和H_2O_2产生的影响
4.2.8 B.graminis特有基因
4.3 结论与讨论
第五章 一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因STPK2的功能分析
5.1 材料与方法
5.1.1 供试菌株、品种和载体
5.1.2 菌株的接种、培养和品种的种植
5.1.3 目标基因的选择及其序列分析
5.1.4 VIGS载体的构建
5.1.5 质粒载体导入农杆菌
5.1.6 农杆菌渗入烟草和病毒的接种
5.1.7 RNA的提取和qRT-PCR分析
5.1.8 组织学染色及显微调查
5.1.9 统计分析
5.2 结果与分析
5.2.1 目标基因的选择及序列分析
5.2.2 目标基因靶向区域的预测及脱靶分析
5.2.3 VIGS载体构建
5.2.4 病毒接种体的获得和病毒的接种
5.2.5 目标基因在小麦中的沉默
5.2.6 目标基因沉默对小麦白粉菌发育的影响
5.3 结论与讨论
参考文献
攻博期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3164777
【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：157 页
【学位级别】：博士
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本研究的创新点
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 小麦白粉病的危害
1.2 小麦白粉菌的主要特征及生活史
1.3 小麦白粉菌的小种分化
1.4 禾谷类白粉菌无毒基因研究进展
1.4.1 无毒基因与寄主R基因的识别模型
1.4.2 无毒基因与寄主R基因的互作类型
1.4.3 无毒基因的变异机制
1.4.4 禾谷类白粉菌无毒基因
1.5 禾谷类白粉菌产孢相关基因研究进展
1.5.1 BrlA调控途径
1.5.2 G蛋白介导的信号转导途径
1.5.3 钙离子(Ca~(2+)),MAPK( mitogen-activated protein kinase)和活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)介导的信号通路
1.5.4 不同真菌产孢过程涉及的其他调控因子
1.5.5 白粉菌产孢相关基因研究进展
1.6 本研究的目的和意义
第二章 我国小麦白粉菌致病型多样性分析
2.1 材料与方法
2.1.1 鉴别寄主
2.1.2 白粉菌标样的采集
2.1.3 单孢子菌株的分离、扩繁及保存
2.1.4 苗期致病性测定
2.1.5 侵染型的调查和致病型的表示
2.1.6 毒性复杂度及毒性频率的计算
2.1.7 Pm基因有效性分析
2.1.8 菌株群体内及群体间多样性指数的计算
2.1.9 成对无毒基因位点之间的关联分析
2.2 结果与分析
2.2.1 毒性频率
2.2.2 致病型和毒性复杂度
2.2.3 群体多样性和遗传距离
2.2.4 无毒基因位点之间的关联分析
2.3 结论与讨论
第三章 小麦白粉菌AvrPm2候选基因的克隆
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株的来源及致病型
3.1.2 基因组DNA样品的制备和提取
3.1.3 RNA样品的制备和提取
3.1.4 基因组文库的构建和测序
3.1.5 转录组文库的构建及测序
3.1.6 基因组大小的估算和组装
3.1.7 基因预测
3.1.8 基因功能注释
3.1.9 SNP、InDel及PAV的鉴定
3.1.10 Effector基因的预测
3.1.11 Effector基因的变异及表达特征分析
3.1.12 表型与基因型数据的关联分析
3.1.13 候选无毒基因的PCR确认
3.2 结果与分析
3.2.1 100个菌株的地理来源和致病型多样性
3.2.2 基因组序列的组装和质量评估
3.2.3 重复序列和非编码RNA的预测
3.2.4 基因预测
3.2.5 基因注释
3.2.6 Effector基因的预测及表达谱分析
3.2.7 99个菌株在基因组水平上的变异
3.2.8 AvrPm2候选基因的鉴定
3.2.9 AvrPm2候选基因的PCR验证
3.2.10 AvrPm2候选基因的序列,注释及表达特征分析
3.3 结论与讨论
第四章 小麦白粉菌产孢相关差异表达基因分析
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株的培养和接种
4.1.2 转录组测序组织样的准备和RNA的提取
4.1.3 总RNA的检测和文库的构建及测序
4.1.4 序列质量的评估
4.1.5 基因差异表达分析
4.1.6 差异表达基因的注释
4.1.7 定量反转录PCR分析(quantitative reverse-transcriptase PCR, qRT-PCR)
4.1.8 参与基础代谢的基因的鉴定
4.1.9 参与信号通路和转录调控基因的鉴定
4.1.10 B.graminis特有基因的鉴定
4.1.11 EGTA和TFP的处理
4.1.12 染色和组织学观察
4.1.13 统计分析
4.2 结果与分析
4.2.1 小麦白粉菌的无性发育过程
4.2.2 高质量RNA-seq数据的获得
4.2.3 产孢阶段的基因差异表达分析
4.2.4 参与碳水化合物代谢,能量代谢和不饱和脂肪酸代谢的差异表达基因分析
4.2.5 抗氧化系统的激活及H_2O_2在分生孢子梗中的积累
4.2.6 白粉菌产孢过程中参与主要信号通路和转录调控的差异表达基因分析
4.2.7 Ca~(2+)螯合剂EGTA和钙调蛋白抑制剂TFP对白粉菌产孢和H_2O_2产生的影响
4.2.8 B.graminis特有基因
4.3 结论与讨论
第五章 一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因STPK2的功能分析
5.1 材料与方法
5.1.1 供试菌株、品种和载体
5.1.2 菌株的接种、培养和品种的种植
5.1.3 目标基因的选择及其序列分析
5.1.4 VIGS载体的构建
5.1.5 质粒载体导入农杆菌
5.1.6 农杆菌渗入烟草和病毒的接种
5.1.7 RNA的提取和qRT-PCR分析
5.1.8 组织学染色及显微调查
5.1.9 统计分析
5.2 结果与分析
5.2.1 目标基因的选择及序列分析
5.2.2 目标基因靶向区域的预测及脱靶分析
5.2.3 VIGS载体构建
5.2.4 病毒接种体的获得和病毒的接种
5.2.5 目标基因在小麦中的沉默
5.2.6 目标基因沉默对小麦白粉菌发育的影响
5.3 结论与讨论
参考文献
攻博期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3164777
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