蜡样芽孢杆菌蛋白质量控制系统ClpX/Hsp100家族组分的生理功能分析
发布时间：2021-04-29 07:11
蛋白质量控制系统是原核和真核细胞中广泛存在的一种蛋白降解机制,对于维持细胞内环境的稳定和调节细胞对于环境条件改变尤其是逆境胁迫适应发挥作用。蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）0-9是前期研究中从小麦根系分离得到的一株内生细菌,能产生芽孢和生物薄膜,具有较强的运动能力,能够在小麦内部稳定生存,对于包括小麦纹枯病和小麦根腐病等多种植物土传病害具有生防能力。生防细菌对于环境的高度适应是其发挥作用的前提。目前,有关B.cereus中是否存在蛋白质量控制系统尚未见报道。研究召.cereus的蛋白质量控制系统有助于揭示回答细菌的环境适应机制,对于开发植物病害生防制剂奠定基础。本研究利用基因序列分析软件分析B.cereus 0-9基因组序列,分析出与依赖Clpx/Hspl00蛋白家族相关功能性基因共11基因。通过进行引物设计,构建敲除载体,完成敲除载体的遗传转化,最终成功构建11个基因缺失菌株。分别是0-9（△clpB）、0-9（△clpC）、0-9（AclpPl）、0-9（△clpP2）、0-9（△ftsH）、0-9（△clpX）、0-9（△tepA）、0-9（△lonN）、0-9（△l...
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 蛋白质量控制系统
1.1.1 蛋白质降解的类型
1.1.2 蛋白酶Clp的结构与功能
1.1.3 肽酶ClpP
1.1.4 解折叠酶的组件(ClpX/ClpA/ClpC)
1.1.5 解折叠酶-氨基肽酶复合体
1.2 蛋白质量控制系统在细菌中的功能
1.3 研究意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 实验质粒
2.1.3 实验所用引物
2.1.4 培养基
2.1.5 实验试剂
2.2 实验过程中涉及的实验方法
2.2.1 快速提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA方法
2.2.2 DNA快速纯化回收方法
2.2.3 GM 2163电击感受态制备方法
2.2.4 芽孢杆菌0-9电击感受态制备方法
2.2.5 质粒小量提取方法
2.2.6 敲除载体pMAD-XX的构建
2.3 实验过程
2.3.1 基因敲除
2.3.2 基因缺陷型菌株和0-9野生型菌株表型测定
2.3.3 clpX与ftsH基因回补
2.3.4 回补型菌株表型测定
2.3.5 clpX基因表达量的测定
2.3.6 clpX基因鉴定
2.3.7 clpP1,clpP2双敲除及表型测定
3 结果与分析
3.1 获得ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除菌株
3.1.1 ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除载体构建
3.1.2 获得Clpx/Hsp100蛋白家族基因缺失菌株
3.2 基因缺陷型菌株与野生型菌株表型测定
3.2.1 细菌生长曲线测定
3.2.2 菌体形态观察
3.2.3 产芽孢能力测定
3.2.4 运动能力测定
3.2.5 生物薄膜实验
3.2.6 合成培养基Msgg点板测定
3.2.7 产蛋白酶测定
3.2.8 高NaCl耐受性测定
3.2.9 维生素K耐受性测定
3.2.10 高温耐受性测定
3.2.11 菌液与真菌的平板对峙。
3.2.12 菌体发酵液与真菌的对峙实验
3.3 clpX与ftsH基因回补菌株
3.3.1 clpX与ftsH基因回补载体构建
3.3.2 ftsh基因回补菌株验证
3.4 互补菌株的表型测定
3.4.1 芽孢观察
3.4.2 运动能力测定
3.4.3 产生物薄膜测定
3.4.4 菌体的观察
3.4.5 菌落形态的观察
3.5 clpX基因表达量的测定
3.6 clpX基因的鉴定
3.7 0-9(△clpP1 clpP2)菌株的表型测定
3.7.1 运动性实验
3.7.2 生物膜实验
3.7.3 产芽孢实验
4 结论
5 讨论
6 展望
参考文献
致谢
本文编号：3167091
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 蛋白质量控制系统
1.1.1 蛋白质降解的类型
1.1.2 蛋白酶Clp的结构与功能
1.1.3 肽酶ClpP
1.1.4 解折叠酶的组件(ClpX/ClpA/ClpC)
1.1.5 解折叠酶-氨基肽酶复合体
1.2 蛋白质量控制系统在细菌中的功能
1.3 研究意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 实验质粒
2.1.3 实验所用引物
2.1.4 培养基
2.1.5 实验试剂
2.2 实验过程中涉及的实验方法
2.2.1 快速提取蜡样芽孢杆菌基因组DNA方法
2.2.2 DNA快速纯化回收方法
2.2.3 GM 2163电击感受态制备方法
2.2.4 芽孢杆菌0-9电击感受态制备方法
2.2.5 质粒小量提取方法
2.2.6 敲除载体pMAD-XX的构建
2.3 实验过程
2.3.1 基因敲除
2.3.2 基因缺陷型菌株和0-9野生型菌株表型测定
2.3.3 clpX与ftsH基因回补
2.3.4 回补型菌株表型测定
2.3.5 clpX基因表达量的测定
2.3.6 clpX基因鉴定
2.3.7 clpP1,clpP2双敲除及表型测定
3 结果与分析
3.1 获得ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除菌株
3.1.1 ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除载体构建
3.1.2 获得Clpx/Hsp100蛋白家族基因缺失菌株
3.2 基因缺陷型菌株与野生型菌株表型测定
3.2.1 细菌生长曲线测定
3.2.2 菌体形态观察
3.2.3 产芽孢能力测定
3.2.4 运动能力测定
3.2.5 生物薄膜实验
3.2.6 合成培养基Msgg点板测定
3.2.7 产蛋白酶测定
3.2.8 高NaCl耐受性测定
3.2.9 维生素K耐受性测定
3.2.10 高温耐受性测定
3.2.11 菌液与真菌的平板对峙。
3.2.12 菌体发酵液与真菌的对峙实验
3.3 clpX与ftsH基因回补菌株
3.3.1 clpX与ftsH基因回补载体构建
3.3.2 ftsh基因回补菌株验证
3.4 互补菌株的表型测定
3.4.1 芽孢观察
3.4.2 运动能力测定
3.4.3 产生物薄膜测定
3.4.4 菌体的观察
3.4.5 菌落形态的观察
3.5 clpX基因表达量的测定
3.6 clpX基因的鉴定
3.7 0-9(△clpP1 clpP2)菌株的表型测定
3.7.1 运动性实验
3.7.2 生物膜实验
3.7.3 产芽孢实验
4 结论
5 讨论
6 展望
参考文献
致谢
本文编号：3167091
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