Hfq蛋白对大熊猫源枯草芽孢杆菌高纤维环境适应能力的影响
发布时间：2021-06-16 06:46
枯草芽孢杆菌（Bacillus subiilis）是一种典型的革兰氏阳性菌,能够分泌纤维素酶提高大熊猫对竹子中纤维素的消化率,还能够通过产生抗菌肽以及营造肠道厌氧环境来维持肠道菌群平衡,保持大熊猫肠道健康,是目前制备大熊猫益生菌添加剂的侯选菌株之一。成年大熊猫以竹子为主食,其肠道内部是一个典型的高纤维环境。高纤维环境对于枯草芽孢杆菌而言是一种压力胁迫环境,适应大熊猫肠道高纤维环境是枯草芽孢杆菌发挥各种益生功能的前提,因此本研究希望找到影响枯草芽孢杆菌高纤维环境适应能力的关键因素,为之后利用基因工程技术改造枯草芽孢杆菌,得到对高纤维环境适应能力更强,能够更好发挥益生作用的菌株提供指导。Hfq（a host factor for RNA phage Qβ）蛋白是一种广泛存在于细菌细胞内的调控蛋白,作为转录后调控的关键因子,对细菌包括适应压力环境在内的多项生命活动都起到了重要的调控作用。但是Hfq蛋白在枯草芽孢杆菌适应大熊猫肠道高纤维环境的过程是否起到调控作用尚不清楚,为了研究Hfq蛋白在枯草芽孢杆菌适应大熊猫肠道高纤维环境的过程中是否具有调控作用,本研究对实验室保存的大熊猫源枯草芽孢杆菌B...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１敲除载体ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ构建流程图??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ??
向６０?ｊａＬ?ＨＨ２感受态细胞中加入５０?ｎｇ敲除载体ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ?（１－８?ｐＬ），??冰浴２?ｍｉｎ后将菌液加入预冷的电转杯中（１?ｍｍ），电击一次，电转条件为１９００ｖ，??１ｍｍ。（电击结果：时间常数＝４．５－５．０?ｍｓ，如果时间常数小于４．２?ｍｓ，则需要增??加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化率）。电??击完毕后取出电转杯并立即加入１?ｍＬ?３７?°Ｃ预热培养基ＲＭ，３７?°Ｃ，?２００?ｒ／ｍｉｎ??复苏培养３?ｈ后，取５０?ｕＬ菌液涂布ＬＢ－Ｅｍ?（０．５?吨／ｍＬ）平板，３７?°Ｃ，倒置培??养２４?ｈ。挑取单菌落在ＬＢ－Ｅｍ液体培养基中扩大培养，取菌液进行ＰＣＲ鉴定。??ｈｆｑ基因缺失株构建结构示意图如图２－２所示，针对缺失株的基因序列设计两对??特异性鉴定引物?ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?和?Ｐａｐａｃ－Ｆ、ｈｆｑ－Ｒｌ：ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?用于扩增用??于扩增ｈｆｑ基因同源序列上游和插入失活载体ｌａｃＺ基因位点的序列，ｈｆｑ－Ｒｌ，??Ｐａｐａｃ－Ｆ用于扩增ｈｆｑ基因同源序列下游和插入失活载体Ｐｓｐａｃ基因位点的序列，??引物序列见本章表２－４，?ＰＣＲ反应体系及反应条件同本章２．３，将ＰＣＲ鉴定结果??正确的菌株送到擎科生物公司测序。??Ｐｓｐａｃ??
提取??的ＤＮＡ通过１?％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果如图２－３所示，显示基因??组ＤＮＡ提取效果较好，没有蛋白、酚等杂质的污染。??Ｍ?１?２?３?４?５?Ｍ??ｆＭｓ－，?＾?？??２０００?—??＇、、心＇，，??１０００?—??：？〇－??５００?—??…’?、、’??图２－３?ＨＨ２基因组ＤＮＡ屯泳结果??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ＤＮＡ?条带??Ｆｉｇ．?２－３?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｒｅｓｕＬｔｓ?ｏｆ?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ｇｅｎｏｍｅ?ＤＮＡ??３．２?ｈｆｑ基因同源序列ＰＣＲ扩增与回收纯化??以ｈｆｑ－Ｆ和ｈｆｑ－Ｒ为引物，５．仰汾／ｔｏ?ＨＨ２基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ｈｆｑ??基因同源片段，扩增产物电泳通过１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图２－４，在??１７０?ｂｐ左右出现特异性条带
【参考文献】：
期刊论文
[1]华北地区圈养大熊猫粪便中产纤维素酶芽孢杆菌菌株的分离与鉴定[J]. 武红敏,郭威,郭晓军,周贤,朱宝成. 河北大学学报(自然科学版). 2016(06)
[2]细菌Hfq蛋白的结构、功能及作用机制[J]. 樊奔,陈晟,李昱龙. 南京林业大学学报(自然科学版). 2016(05)
[3]原核微生物基因敲除策略的研究进展[J]. 阳燕,杨英明,胡涛. 国际口腔医学杂志. 2016(05)
[4]纤维素酶降解纤维素机理的研究进展[J]. 于跃,张剑. 化学通报. 2016(02)
[5]基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用[J]. 秦智娟,杨晓清,张玉泉. 国际生殖健康/计划生育杂志. 2016(01)
[6]ncRNA伴侣分子hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境适应能力的影响[J]. 卢海亭,乔军,孟庆玲,彭叶龙,陈诚,刘田莉,谢堃,才学鹏,陈创夫. 应用与环境生物学报. 2015(06)
[7]表达hrpZPsg12基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株构建及其生防活性评价[J]. 王雪,田佳,徐琳琳,卢宝慧,杨丽娜,高洁. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2015(11)
[8]幽门螺杆菌多重耐药株hefA基因表达的检测与分析[J]. 王欢,毕红燕,潘科,綦廷娜,毕雅坤,王菲,陈峥宏. 中国病原生物学杂志. 2015(05)
[9]大熊猫取食竹种纤维类物质分析[J]. 孙雪,林达,张庆,贾竞波. 野生动物学报. 2015(02)
[10]细菌sRNA对环境胁迫的响应机制[J]. 刘福芮,钟志军,周紫峣,彭广能,杨平,王亚萍,廖莉. 微生物学通报. 2015(10)
硕士论文
[1]变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH、clpP基因的表达差异分析[D]. 李朋莲.吉林大学 2015
[2]竹子纤维素及其衍生的纳米材料[D]. 张鹏鹏.浙江工业大学 2014
本文编号：3232585
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１敲除载体ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ构建流程图??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ??
向６０?ｊａＬ?ＨＨ２感受态细胞中加入５０?ｎｇ敲除载体ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ?（１－８?ｐＬ），??冰浴２?ｍｉｎ后将菌液加入预冷的电转杯中（１?ｍｍ），电击一次，电转条件为１９００ｖ，??１ｍｍ。（电击结果：时间常数＝４．５－５．０?ｍｓ，如果时间常数小于４．２?ｍｓ，则需要增??加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化率）。电??击完毕后取出电转杯并立即加入１?ｍＬ?３７?°Ｃ预热培养基ＲＭ，３７?°Ｃ，?２００?ｒ／ｍｉｎ??复苏培养３?ｈ后，取５０?ｕＬ菌液涂布ＬＢ－Ｅｍ?（０．５?吨／ｍＬ）平板，３７?°Ｃ，倒置培??养２４?ｈ。挑取单菌落在ＬＢ－Ｅｍ液体培养基中扩大培养，取菌液进行ＰＣＲ鉴定。??ｈｆｑ基因缺失株构建结构示意图如图２－２所示，针对缺失株的基因序列设计两对??特异性鉴定引物?ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?和?Ｐａｐａｃ－Ｆ、ｈｆｑ－Ｒｌ：ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?用于扩增用??于扩增ｈｆｑ基因同源序列上游和插入失活载体ｌａｃＺ基因位点的序列，ｈｆｑ－Ｒｌ，??Ｐａｐａｃ－Ｆ用于扩增ｈｆｑ基因同源序列下游和插入失活载体Ｐｓｐａｃ基因位点的序列，??引物序列见本章表２－４，?ＰＣＲ反应体系及反应条件同本章２．３，将ＰＣＲ鉴定结果??正确的菌株送到擎科生物公司测序。??Ｐｓｐａｃ??
提取??的ＤＮＡ通过１?％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果如图２－３所示，显示基因??组ＤＮＡ提取效果较好，没有蛋白、酚等杂质的污染。??Ｍ?１?２?３?４?５?Ｍ??ｆＭｓ－，?＾?？??２０００?—??＇、、心＇，，??１０００?—??：？〇－??５００?—??…’?、、’??图２－３?ＨＨ２基因组ＤＮＡ屯泳结果??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ＤＮＡ?条带??Ｆｉｇ．?２－３?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｒｅｓｕＬｔｓ?ｏｆ?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ｇｅｎｏｍｅ?ＤＮＡ??３．２?ｈｆｑ基因同源序列ＰＣＲ扩增与回收纯化??以ｈｆｑ－Ｆ和ｈｆｑ－Ｒ为引物，５．仰汾／ｔｏ?ＨＨ２基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ｈｆｑ??基因同源片段，扩增产物电泳通过１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图２－４，在??１７０?ｂｐ左右出现特异性条带
【参考文献】：
期刊论文
[1]华北地区圈养大熊猫粪便中产纤维素酶芽孢杆菌菌株的分离与鉴定[J]. 武红敏,郭威,郭晓军,周贤,朱宝成. 河北大学学报(自然科学版). 2016(06)
[2]细菌Hfq蛋白的结构、功能及作用机制[J]. 樊奔,陈晟,李昱龙. 南京林业大学学报(自然科学版). 2016(05)
[3]原核微生物基因敲除策略的研究进展[J]. 阳燕,杨英明,胡涛. 国际口腔医学杂志. 2016(05)
[4]纤维素酶降解纤维素机理的研究进展[J]. 于跃,张剑. 化学通报. 2016(02)
[5]基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用[J]. 秦智娟,杨晓清,张玉泉. 国际生殖健康/计划生育杂志. 2016(01)
[6]ncRNA伴侣分子hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境适应能力的影响[J]. 卢海亭,乔军,孟庆玲,彭叶龙,陈诚,刘田莉,谢堃,才学鹏,陈创夫. 应用与环境生物学报. 2015(06)
[7]表达hrpZPsg12基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株构建及其生防活性评价[J]. 王雪,田佳,徐琳琳,卢宝慧,杨丽娜,高洁. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2015(11)
[8]幽门螺杆菌多重耐药株hefA基因表达的检测与分析[J]. 王欢,毕红燕,潘科,綦廷娜,毕雅坤,王菲,陈峥宏. 中国病原生物学杂志. 2015(05)
[9]大熊猫取食竹种纤维类物质分析[J]. 孙雪,林达,张庆,贾竞波. 野生动物学报. 2015(02)
[10]细菌sRNA对环境胁迫的响应机制[J]. 刘福芮,钟志军,周紫峣,彭广能,杨平,王亚萍,廖莉. 微生物学通报. 2015(10)
硕士论文
[1]变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH、clpP基因的表达差异分析[D]. 李朋莲.吉林大学 2015
[2]竹子纤维素及其衍生的纳米材料[D]. 张鹏鹏.浙江工业大学 2014
本文编号：3232585
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