小麦条锈菌效应蛋白Pst06941靶标的鉴定及功能分析
发布时间：2021-07-05 22:55
由专性活体营养寄生菌条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麦条锈病严重威胁及危害着小麦的安全生产。然而,由于病原菌的毒性频率变化之快以及毒性变异方式的多元化,使得目前生产上使用的小麦抗性品种存在抗病性逐渐减弱甚至丧失等问题。条锈菌可以通过吸器分泌一些毒性因子,特别是一些参与致病相关进程的效应蛋白,从而影响小麦产量。鉴于此,对于此类效应蛋白相关功能的探究与剖析,将有助于我们准确把握条锈菌致病机理,对于以后开展条锈病的防控具有重要的理论指导意义。在前期研究中,我们借助于生物信息学的相关分析手段,以及结合酵母分泌系统、农杆菌介导的瞬时表达和病毒介导的基因沉默技术（VIGS）筛选到了一个条锈菌典型的效应蛋白Pst06941。在此基础上,利用酵母筛库获得了几个其在寄主中的潜在候选靶标蛋白,运用酵母双杂交、BIFC及pull-down实验证实其中一个是效应蛋白Pst06941在小麦中的靶标,即小麦的NADH脱氢酶亚基I（TaNADH Ⅰ）。在植物体中,NADH脱氢酶通常是以一种复合体的方式普遍存在,而I型的NADH脱氢酶则是在电子传递的过...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TaNADHI与Pst06941酵母双杂交验证
第二章 小麦条锈菌效应蛋白 Pst06941 靶标的筛选及验证2.4.2.2 双分子荧光互作验证通过酵母双杂交的技术手段已经证明 TaNADH I 与 Pst06941 存在互作关系接着借助烟草过表达系统对这两者的互作关系进行进一步的验证。将基因Pst06941 构建到载体 SPYCE 上，将 TaNADH I 基因构建到载体 SPYNE 上，经过转化、摇菌、浓度稀释等步骤后，将菌液进行均等量的混合并共同注射到适宜的烟草叶片上，2 天左右在显微镜下进行表达情况的镜检观察，并选取清晰的视野进行拍照。结果发现，分别带有黄色荧光标签 YFP 的 C 末端和 N 末端的 Pst0694和 TaNADH I 能够发生相互融合，让 YFP 得以正常的表达，且能在显微镜下被清晰的捕捉到，从而进一步证明 Pst06941 和 TaNADH I 存在互作关系（图 2-2）
西北农林科技大学硕士学位论文照 GST 空载体也进行体外蛋白的诱导表达。之后利用 Thermos 公司的 GST-Pulldown 试剂盒进行蛋白的互作验证。在此过程中，先将阴性对照 GST 蛋白和GST-TaNADH I 分别结合在含有 GST 填料的柱子，之后再将携带有 His 标签的Pst06941 可溶性蛋白分别添加在上述两个柱子中，共同孵育，蛋白得到成功的洗脱且收集后进行 Western 印迹分析。试验结果显示，阴性对照 GST、GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 蛋白在体外均得到了有效表达，在 Western 印记分析中两个标签均能够与相应抗体结合并被显色；在试验组中，阴性对照 GST 与 His-Pst06941 这一组合仅杂到了 GST 对照蛋白，而 GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 这一组合中 GST 与 His 标签均能够被印迹和显色，充分表明这两者存在互作关系（图 2-3）。
【参考文献】：
博士论文
[1]Ⅱ型NADH脱氢酶NDH2的结构与功能研究[D]. 李文斐.清华大学 2015
[2]拟南芥线粒体中交替型NAD（P）H脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用研究[D]. 徐晓丽.兰州大学 2010
硕士论文
[1]杨树叶绿体NADH脱氢酶基因的克隆与序列分析[D]. 杨建国.山西农业大学 2014
本文编号：3266988
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TaNADHI与Pst06941酵母双杂交验证
第二章 小麦条锈菌效应蛋白 Pst06941 靶标的筛选及验证2.4.2.2 双分子荧光互作验证通过酵母双杂交的技术手段已经证明 TaNADH I 与 Pst06941 存在互作关系接着借助烟草过表达系统对这两者的互作关系进行进一步的验证。将基因Pst06941 构建到载体 SPYCE 上，将 TaNADH I 基因构建到载体 SPYNE 上，经过转化、摇菌、浓度稀释等步骤后，将菌液进行均等量的混合并共同注射到适宜的烟草叶片上，2 天左右在显微镜下进行表达情况的镜检观察，并选取清晰的视野进行拍照。结果发现，分别带有黄色荧光标签 YFP 的 C 末端和 N 末端的 Pst0694和 TaNADH I 能够发生相互融合，让 YFP 得以正常的表达，且能在显微镜下被清晰的捕捉到，从而进一步证明 Pst06941 和 TaNADH I 存在互作关系（图 2-2）
西北农林科技大学硕士学位论文照 GST 空载体也进行体外蛋白的诱导表达。之后利用 Thermos 公司的 GST-Pulldown 试剂盒进行蛋白的互作验证。在此过程中，先将阴性对照 GST 蛋白和GST-TaNADH I 分别结合在含有 GST 填料的柱子，之后再将携带有 His 标签的Pst06941 可溶性蛋白分别添加在上述两个柱子中，共同孵育，蛋白得到成功的洗脱且收集后进行 Western 印迹分析。试验结果显示，阴性对照 GST、GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 蛋白在体外均得到了有效表达，在 Western 印记分析中两个标签均能够与相应抗体结合并被显色；在试验组中，阴性对照 GST 与 His-Pst06941 这一组合仅杂到了 GST 对照蛋白，而 GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 这一组合中 GST 与 His 标签均能够被印迹和显色，充分表明这两者存在互作关系（图 2-3）。
【参考文献】：
博士论文
[1]Ⅱ型NADH脱氢酶NDH2的结构与功能研究[D]. 李文斐.清华大学 2015
[2]拟南芥线粒体中交替型NAD（P）H脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用研究[D]. 徐晓丽.兰州大学 2010
硕士论文
[1]杨树叶绿体NADH脱氢酶基因的克隆与序列分析[D]. 杨建国.山西农业大学 2014
本文编号：3266988
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