荔枝霜疫霉M90和MAPK10的功能分析

发布时间：2022-02-24 16:52

　　由荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.）引起的霜疫病是我国荔枝生产过程中为害最严重的病害。该病原菌隶属卵菌,为二倍体生物且在遗传进化上与真菌的亲缘关系甚远,致使用于防治真菌病害的广谱性杀菌剂对其防治效果不佳,且先前的基因敲除技术不适于研究其功能基因。本研究基于聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）介导的原生质体转化技术与外源双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）介导的转录后基因沉默策略对荔枝霜疫霉M90与MAPK10两个基因在病原菌生活史和致病性方面的作用与功能进行了研究,主要结果如下:1.通过对荔枝霜疫霉全基因组进行分析,筛选到一个与致病疫霉（Phytophthora infestans）RNA结合蛋白M90相似度达73%的同源蛋白,将其命名为Peronophythora litchii M90（PlM90）。对荔枝霜疫霉M90蛋白与致病疫霉、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、拟南芥霜霉（Hyaloperonospora arabidopsidis）、向日葵霜霉（Pl... 

【文章来源】：华南农业大学广东省

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
缩略词及中英文对照
第一章 前言
    1.1 荔枝霜疫病的研究概况
        1.1.1 荔枝的经济意义
        1.1.2 荔枝霜疫病的危害
        1.1.3 荔枝霜疫霉的分类地位与生物学特性
        1.1.4 荔枝霜疫霉的生活史与田间发生流行规律
        1.1.5 荔枝霜疫病的防治研究
            1.1.5.1 农业防治
            1.1.5.2 化学防治
            1.1.5.3 生物防治
    1.2 RNA结合蛋白的研究进展
        1.2.1 RNA结合蛋白概述
        1.2.2 RNA结合蛋白在动物中的研究进展
        1.2.3 RNA结合蛋白在植物中的研究进展
        1.2.4 RNA结合蛋白在真菌中的研究进展
        1.2.5 RNA结合蛋白在卵菌中的研究进展
    1.3 促有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的研究进展
        1.3.1 MAPK概述
        1.3.2 MAPK级联反应
        1.3.3 MAPK信号通路在真菌中的研究进展
            1.3.3.1 性激素应答信号通路的研究进展
            1.3.3.2 细胞壁完整性信号通路的研究进展
            1.3.3.3 高渗透压调节信号通路的研究进展
        1.3.4 MAPK信号通路在卵菌中的研究进展
    1.4 RNA干扰技术在基因功能研究方面的研究进展
        1.4.1 RNA干扰技术概述
        1.4.2 RNA干扰技术的发现
        1.4.3 RNA干扰技术的机制
        1.4.4 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用
            1.4.4.1 RNA干扰技术在控制动物疾病研究中的应用
            1.4.4.2 RNA干扰技术在植物基因功能研究中的应用
            1.4.4.3 RNA干扰技术在真菌基因功能研究中的应用
            1.4.4.4 RNA干扰技术在卵菌基因功能研究中的应用
    1.5 聚乙二醇介导原生质体转化技术在基因功能研究方面的研究进展
        1.5.1 PEG介导原生质体转化技术简介
        1.5.2 PEG介导转化技术在高等植物遗传转化中的研究进展
        1.5.3 PEG介导转化技术在真菌遗传转化中的研究进展
    1.6 转录组学的研究进展
        1.6.1 转录组学概述
        1.6.2 转录组学研究技术与方法
        1.6.3 转录组学在水产动物研究中的运用
        1.6.4 转录组学在木本植物研究中的运用
        1.6.5 转录组学在环境微生物研究中的运用
    1.7 研究目的与意义
第二章 荔枝霜疫霉M90基因的克隆与功能分析
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 供试材料
            2.2.1.1 供试菌株与载体
            2.2.1.2 主要供试培养基及转化试剂配方
            2.2.1.3 主要仪器设备
        2.2.2 试验方法
            2.2.2.1 荔枝霜疫霉的分离
            2.2.2.2 荔枝霜疫霉的纯化
            2.2.2.3 荔枝霜疫霉的保存
            2.2.2.4 PlM90基因的同源比对与系统发育分析
            2.2.2.5 PlM90基因的转录模式分析
            2.2.2.6 沉默载体pHAM34::PlM90的构建
            2.2.2.7 荔枝霜疫霉原生质体的制备及PEG介导的转化
            2.2.2.8 PlM90基因沉默转化子的筛选及验证
            2.2.2.9 PlM90基因沉默转化子的表型分析
            2.2.2.10 转录组测序RNA样品的准备、提取与检测
            2.2.2.11 转录组测序及分析方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PlM90基因编码一个Puf家族中的RNA结合蛋白
        2.3.2 PlM90基因的生活史阶段与侵染阶段的转录模式
        2.3.3 PlM90基因沉默载体的构建
            2.3.3.1 荔枝霜疫霉基因组的提取及目的基因PlM90的克隆
            2.3.3.2 pHAM34::PlM90沉默载体的构建
        2.3.4 PlM90基因沉默转化子的筛选
        2.3.5 PlM90基因沉默转化子的表型分析
            2.3.5.1 PlM90基因的沉默影响菌丝生长速率
            2.3.5.2 PlM90基因的沉默影响游动孢子的释放而不影响孢子囊的产量
            2.3.5.3 PlM90基因的沉默影响游动孢子的休止而不影响休止孢的萌发
            2.3.5.4 PlM90基因的沉默严重影响卵孢子的产量
            2.3.5.5 PlM90基因的沉默不影响致病性
        2.3.6 PlM90基因沉默转化子的转录组分析
            2.3.6.1 RNA质量检测结果参数
            2.3.6.2 转录组测序质量分析
            2.3.6.3 荔转录组基因表达差异
            2.3.6.4 差异表达基因的GO富集分析
            2.3.6.5 差异表达基因的KEGG通路分析
    2.4 小结
第三章 荔枝霜疫霉MAPK10基因的克隆与功能分析
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 供试材料
            3.2.1.1 供试菌株与载体
            3.2.1.2 主要供试培养基及主要试剂配方
            3.2.1.3 主要仪器设备
            3.2.1.4 其他实验器具
        3.2.2 试验方法
            3.2.2.1 PlMAPK10基因的同源比对与系统发育分析
            3.2.2.2 PlMAPK10基因转录模式的分析
            3.2.2.3 沉默载体p TORmRFP4::PlMAPK10的构建
            3.2.2.4 荔枝霜疫霉原生质体的制备及聚乙二醇PEG介导的转化
            3.2.2.5 PlMAPK10基因沉默转化子的筛选及验证
            3.2.2.6 PlMAPK10基因沉默转化子的表型分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 PlMAPK10基因编码一个促有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK
        3.3.2 PlMAPK10基因在无性发育阶段与侵染阶段的转录模式
        3.3.3 PlMAPK10基因沉默载体的构建
            3.3.3.1 荔枝霜疫霉基因组的提取及目的基因PlMAPK10的克隆
            3.3.3.2 沉默载体p TORmRFP4::PlMAPK10的构建
        3.3.4 PlMAPK10基因沉默转化子的获得
        3.3.5 PlMAPK10基因沉默转化子的筛选与验证
        3.3.6 PlMAPK10基因的沉默是特异的
        3.3.7 PlMAPK10基因沉默转化子的表型分析
            3.3.7.1 PlMAPK10基因的沉默不影响卵孢子的形成
            3.3.7.2 PlMAPK10基因的沉默影响菌丝生长速率
            3.3.7.3 PlMAPK10基因的沉默减少游动孢子囊的产量而不影响其释放游动孢子
            3.3.7.4 PlMAPK10基因的沉默不影响游动孢子的休止与休止孢的萌发
            3.3.7.5 PlMAPK10基因的沉默导致荔枝霜疫霉的致病性下降
            3.3.7.6 PlMAPK10基因的表达不受氧化压力的调控
            3.3.7.7 PlMAPK10基因的沉默影响荔枝霜疫霉漆酶活性而不影响胞外氧化酶的活性
            3.3.7.8 PlMAPK10基因沉默转化子胞外氧化酶与漆酶基因转录水平的检测
    3.4 小结
第四章 全文讨论与总结论
    4.1 RNA结合蛋白编码基因PlM90在荔枝霜疫霉有性生殖与无性生殖方面的重要作用
        4.1.1 PlM90基因编码的Puf RNA结合蛋白在卵菌中高度保守
        4.1.2 PlM90基因影响荔枝霜疫霉的有性生殖过程
        4.1.3 PlM90基因影响荔枝霜疫霉的无性生殖过程
    4.2 PlMAPK10基因在荔枝霜疫霉致病性与漆酶活性方面的重要作用
        4.2.1 荔枝霜疫霉MAPK10基因在卵菌中高度保守
        4.2.2 PlMAPK10基因在荔枝霜疫霉有性生殖与无性发育阶段的作用
        4.2.3 PlMAPK10基因的沉默减弱了荔枝霜疫霉的致病性
        4.2.4 PlMAPK10基因在调控荔枝霜疫霉应对植物防卫反应方面的作用
    4.3 dsRNA介导的转录后基因沉默策略与PEG介导的原生质体转化技术在卵菌中的应用与展望
    4.4 总结论
致谢
参考文献
附录
    附录A 酪氨酸代谢通路
    附录B 氰基氨基酸代谢通路
    附录C 氨基糖与核苷酸糖代谢通路
    附录D 花生四烯酸代谢通路
    附录E 攻读博士学位期间发表的论文、专利与会议摘要


【参考文献】：
期刊论文
[1]漆酶的研究进展及其应用[J]. 刘岩,刘锐,苏新国,赵冠里,杨昭.  安徽农学通报. 2016(13)
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[3]大豆疫霉PsMPK1沉默突变体的基因表达谱分析[J]. 叶文武,张萌,曹明娜,翟春花,李爱宁,王源超.  南京农业大学学报. 2016(03)
[4]转录组学在果蔬采后衰老生物学中的研究进展[J]. 王金花,郜海燕,许晴晴,穆宏磊,葛林梅,宋丽丽.  浙江农业科学. 2014(07)
[5]PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立[J]. 刘莉,肖招燕,郭丽琼,林俊芳,尤琳烽,廖静文.  菌物学报. 2014(01)
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[7]猴头菌锰过氧化物酶1基因在构巢曲霉的异源转化与表达[J]. 尹立伟,池玉杰.  林业科学研究. 2013(04)
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[9]无花果ACS1基因RNAi植物表达载体构建[J]. 唐霞,张帅,马俊莲,张子德.  河北农业大学学报. 2013(04)
[10]两株银杏内生拮抗细菌菌株的鉴定及生防功能基因研究[J]. 杨瑞先,范晓静,蔡学清,陶玉凤,胡方平.  热带作物学报. 2013(03)



本文编号：3643138