十字花科黑腐病菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶影响细胞分裂和致病性的研究
发布时间：2022-09-17 15:11
革兰氏阴性致病细菌进化了一系列不同的分泌系统,如跨越细胞内膜和外膜的Ⅱ型（T2SS）、Ⅲ型（T3SS）和Ⅳ型（T4SS）等分泌系统,这些分泌系统将致病因子转运至宿主细胞引起病害。细菌内外膜之间的周质空间含有严密的肽聚糖（PG）层,它使细胞能承受膨压而维持完整性及特定形状。但是,PG层也成了阻碍分泌系统跨膜组装的屏障。因此,PG层需通过其裂解酶局部重组,为分泌系统的组装提供空间和受体位点。细菌含有三类主要的PG裂解酶,一类是切割肽聚糖骨架中的糖苷键的糖苷酶,第二类是切割肽聚糖侧链的酰胺酶,第三类是切割侧链中的肽链的内切酶。后两类酶对分泌系统的作用还毫无知晓。十字花科黑腐病菌（Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc）的野生型菌株8004含有4种切割肽聚糖侧链的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶,根据它们与大肠杆菌酰胺酶在序列上的同源性和结构上的相似性,命名为AmiC1,AmiC2,AmpD和AmiD。本研究对它们在细胞分裂和致病性中的作用进行了研究。构建了 amiC1、amiC2、ampD、amiD基因的突变体amiC1::pK18、△amiC2、△am...
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写说明
第一章 前言
1.1 植物病原细菌概述
1.2 黄单胞菌属概述
1.2.1 黄单胞菌属简介
1.2.2 黄单胞菌属的致病因子
1.2.3 黄单胞菌属致病系统
1.3 细菌分泌系统概述
1.3.1 Ⅰ型分泌系统
1.3.2 Ⅱ型分泌系统
1.3.3 Ⅲ型分泌系统
1.3.4 Ⅳ型分泌系统
1.3.5 Ⅴ型分泌系统
1.3.6 Ⅵ型分泌系统
1.3.7 Ⅶ型分泌系统
1.3.8 Sec分泌蛋白转运系统
1.3.9 Tat蛋白转运系统
1.4 细菌细胞壁概述
1.5 细菌肽聚糖裂解酶的概述
1.5.1 裂解性糖基转移酶的概述
1.5.2 肽聚糖内切酶的概述
1.5.3 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的概述
1.6 LytM家族的研究进展
1.6.1 NlpD脂蛋白的研究进展
1.6.2 EnvC蛋白的研究进展
1.7 肽聚糖裂解酶影响分泌系统的研究进展
1.8 十字花科黑腐病菌概述
1.9 十字花科黑腐病菌重要致病基因的研究进展
1.10 研究的目的和意义
第二章 材料和方法
2.1 菌株
2.2 质粒
2.3 菌株的培养条件和方法
2.4 总DNA的提取
2.5 质粒的提取
2.6 PCR反应
2.7 DNA的纯化
2.8 琼脂糖凝胶电泳
2.9 酶切反应
2.10 连接反应
2.11 电转化感受态的制作
2.12 转化
2.13 阳性克隆的验证
2.13.1 菌裂解PCR验证
2.13.2 酶切验证
2.14 三亲本接合
2.15 点突变构建策略和方法
2.16 致病性的检测
2.17 过敏反应的检测
2.17.1 定性过敏反应的检测
2.17.2 定量过敏反应的检测
2.18 5'RACE确定转录起始位点
2.19 显微镜观察
2.20 胞外酶的检测
2.20.1 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的平板检测
2.20.2 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的定量检测
2.21 胞外多糖的检测
2.22 运动性的检测
2.23 生物膜的检测
2.24 蛋白的表达
2.25 蛋白的纯化(6×His标签)
2.26 肽聚糖的提取
2.27 肽聚糖与Remazol brilliant blue(RBB)标记
2.28 肽聚糖结合试验
2.29 肽聚糖降解试验
2.30 SDS-PAGE凝胶电泳
2.31 蛋白定量
2.32 Western blotting
2.32.1 试剂耗材的准备
2.32.2 所需溶液
2.32.3 具体操作
2.33 细菌亚细胞定位蛋白的提取
2.33.1 细菌总蛋白的提取
2.33.2 细菌外膜蛋白和内膜蛋白的提取
2.33.3 细菌周质蛋白的提取
2.33.4 细菌胞外蛋白的提取
2.34 GUS酶活的测定
第三章 Xcc编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因突变体及互补菌株的构建
3.1 引言
3.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因
3.3 amiD和ampD缺失突变体的构建
3.4 amiC相关突变体和互补菌株的构建
3.5 小结
第四章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因对细胞分裂和致病性等的影响分析
4.1 引言
4.2 AmiC1是Xcc细胞分裂所必需的,AmiC2起一定的作用
4.3 AmiC1影响Xcc的致病性
4.4 AmiC1影响Xcc在非寄主上的HR
4.5 AmiC1、AmiC2不影响胞外酶但AmiC1影响EPS产量
4.6 AmiC1影响游动性
4.7 小结
第五章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶AmiC1需要潜在激活子的激活
5.1 引言
5.2 AmiC1的E335D点突变互补分析
5.3 带6个组氨酸且去掉信号肽区的AmiC蛋白表达菌株的构建
5.4 体外检测His_6-AmiC1_(LN32)具有微弱的降解肽聚糖的活性
5.5 小结
第六章 Xcc LytM家族蛋白NlpD和EnvC对细胞分裂和致病性等的影响分析
6.1 引言
6.2 LytM家族的生物信息学分析
6.3 从突变体库中获得含有LytM结构域基因的突变体
6.4 LytM结构域的突变体中nlpD和envC突变体影响细胞分裂
6.5 LytM结构域的突变体中nlpD突变体显著影响致病
6.6 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC和NlpD
6.6.1 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC
6.6.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N1pD
6.6.3 Xcc 8004的nlpD基因转录起始位点的确定以及启动子分析
6.7 Xcc 8004中envC、nlpD缺失突变体和互补菌株的构建
6.7.1 envC缺失突变体和互补菌株的构建
6.7.2 nlpD缺失突变体和互补菌株的构建
6.8 envC和nlpD的突变表型分析
6.8.1 envC和nlpD缺失突变体在NYG和MMX上的生长
6.8.2 envC和nlpD缺失突变体影响细胞分裂
6.8.3 nlpD缺失突变体显著影响致病性
6.8.4 nlpD缺失突变体显著影响HR
6.8.5 envC缺失突变体不影响HR
6.8.6 EnvC和NlpD不影响Ⅱ型胞外酶,但NlpD影响EPS的合成
6.8.7 envC和nlpD缺失突变体影响游动性
6.8.8 nlpD缺失突变体影响细胞聚集
6.8.9 nlpD缺失突变体对Zn~(2+)敏感
6.8.10 nlpD缺失突变体对pH敏感
6.9 小结
第七章 Xcc通过NlpD激活AmiC1影响细胞分裂和致病性
7.1 引言
7.2 Xcc中NlpD的亚细胞定位
7.2.1 Xcc 8004在基因组上NlpD融合3×Flag标签的菌株构建
7.2.2 Xcc的NlpD分布在细胞质、周质和外膜
7.3 带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的NlpD和EnvC蛋白的表达纯化
7.4 His_6-NlpDLN22能在体外结合肽聚糖
7.5 His_6-NlpDN22能在体外增强HiS6-AmiC1_(LN32)降解肽聚糖的活性
7.6 AmiC1及其激活子NlpD影响致病性的机制研究
7.6.1 NlpD/EnvC/AmiC不影响Ⅲ型分泌系统hrp基因的表达
7.6.2 NlpD/AmiC1影响Ⅲ型效应物XC3176的分泌
7.7 小结
第八章 结论与讨论
8.1 Xcc的AmiC/NlpD/EnvC参与细胞分裂
8.2 Xcc的AmiC1/NlpD参与致病性
8.3 Xcc的AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族调控蛋白NlpD的激活
8.4 AmiC1/NlpD影响Xcc的Ⅲ型分泌系统,但不影响Ⅱ分泌系统
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表论文情况
本文编号：3679464
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写说明
第一章 前言
1.1 植物病原细菌概述
1.2 黄单胞菌属概述
1.2.1 黄单胞菌属简介
1.2.2 黄单胞菌属的致病因子
1.2.3 黄单胞菌属致病系统
1.3 细菌分泌系统概述
1.3.1 Ⅰ型分泌系统
1.3.2 Ⅱ型分泌系统
1.3.3 Ⅲ型分泌系统
1.3.4 Ⅳ型分泌系统
1.3.5 Ⅴ型分泌系统
1.3.6 Ⅵ型分泌系统
1.3.7 Ⅶ型分泌系统
1.3.8 Sec分泌蛋白转运系统
1.3.9 Tat蛋白转运系统
1.4 细菌细胞壁概述
1.5 细菌肽聚糖裂解酶的概述
1.5.1 裂解性糖基转移酶的概述
1.5.2 肽聚糖内切酶的概述
1.5.3 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的概述
1.6 LytM家族的研究进展
1.6.1 NlpD脂蛋白的研究进展
1.6.2 EnvC蛋白的研究进展
1.7 肽聚糖裂解酶影响分泌系统的研究进展
1.8 十字花科黑腐病菌概述
1.9 十字花科黑腐病菌重要致病基因的研究进展
1.10 研究的目的和意义
第二章 材料和方法
2.1 菌株
2.2 质粒
2.3 菌株的培养条件和方法
2.4 总DNA的提取
2.5 质粒的提取
2.6 PCR反应
2.7 DNA的纯化
2.8 琼脂糖凝胶电泳
2.9 酶切反应
2.10 连接反应
2.11 电转化感受态的制作
2.12 转化
2.13 阳性克隆的验证
2.13.1 菌裂解PCR验证
2.13.2 酶切验证
2.14 三亲本接合
2.15 点突变构建策略和方法
2.16 致病性的检测
2.17 过敏反应的检测
2.17.1 定性过敏反应的检测
2.17.2 定量过敏反应的检测
2.18 5'RACE确定转录起始位点
2.19 显微镜观察
2.20 胞外酶的检测
2.20.1 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的平板检测
2.20.2 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的定量检测
2.21 胞外多糖的检测
2.22 运动性的检测
2.23 生物膜的检测
2.24 蛋白的表达
2.25 蛋白的纯化(6×His标签)
2.26 肽聚糖的提取
2.27 肽聚糖与Remazol brilliant blue(RBB)标记
2.28 肽聚糖结合试验
2.29 肽聚糖降解试验
2.30 SDS-PAGE凝胶电泳
2.31 蛋白定量
2.32 Western blotting
2.32.1 试剂耗材的准备
2.32.2 所需溶液
2.32.3 具体操作
2.33 细菌亚细胞定位蛋白的提取
2.33.1 细菌总蛋白的提取
2.33.2 细菌外膜蛋白和内膜蛋白的提取
2.33.3 细菌周质蛋白的提取
2.33.4 细菌胞外蛋白的提取
2.34 GUS酶活的测定
第三章 Xcc编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因突变体及互补菌株的构建
3.1 引言
3.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因
3.3 amiD和ampD缺失突变体的构建
3.4 amiC相关突变体和互补菌株的构建
3.5 小结
第四章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因对细胞分裂和致病性等的影响分析
4.1 引言
4.2 AmiC1是Xcc细胞分裂所必需的,AmiC2起一定的作用
4.3 AmiC1影响Xcc的致病性
4.4 AmiC1影响Xcc在非寄主上的HR
4.5 AmiC1、AmiC2不影响胞外酶但AmiC1影响EPS产量
4.6 AmiC1影响游动性
4.7 小结
第五章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶AmiC1需要潜在激活子的激活
5.1 引言
5.2 AmiC1的E335D点突变互补分析
5.3 带6个组氨酸且去掉信号肽区的AmiC蛋白表达菌株的构建
5.4 体外检测His_6-AmiC1_(LN32)具有微弱的降解肽聚糖的活性
5.5 小结
第六章 Xcc LytM家族蛋白NlpD和EnvC对细胞分裂和致病性等的影响分析
6.1 引言
6.2 LytM家族的生物信息学分析
6.3 从突变体库中获得含有LytM结构域基因的突变体
6.4 LytM结构域的突变体中nlpD和envC突变体影响细胞分裂
6.5 LytM结构域的突变体中nlpD突变体显著影响致病
6.6 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC和NlpD
6.6.1 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC
6.6.2 生物信息学分析Xcc 8004中的N1pD
6.6.3 Xcc 8004的nlpD基因转录起始位点的确定以及启动子分析
6.7 Xcc 8004中envC、nlpD缺失突变体和互补菌株的构建
6.7.1 envC缺失突变体和互补菌株的构建
6.7.2 nlpD缺失突变体和互补菌株的构建
6.8 envC和nlpD的突变表型分析
6.8.1 envC和nlpD缺失突变体在NYG和MMX上的生长
6.8.2 envC和nlpD缺失突变体影响细胞分裂
6.8.3 nlpD缺失突变体显著影响致病性
6.8.4 nlpD缺失突变体显著影响HR
6.8.5 envC缺失突变体不影响HR
6.8.6 EnvC和NlpD不影响Ⅱ型胞外酶,但NlpD影响EPS的合成
6.8.7 envC和nlpD缺失突变体影响游动性
6.8.8 nlpD缺失突变体影响细胞聚集
6.8.9 nlpD缺失突变体对Zn~(2+)敏感
6.8.10 nlpD缺失突变体对pH敏感
6.9 小结
第七章 Xcc通过NlpD激活AmiC1影响细胞分裂和致病性
7.1 引言
7.2 Xcc中NlpD的亚细胞定位
7.2.1 Xcc 8004在基因组上NlpD融合3×Flag标签的菌株构建
7.2.2 Xcc的NlpD分布在细胞质、周质和外膜
7.3 带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的NlpD和EnvC蛋白的表达纯化
7.4 His_6-NlpDLN22能在体外结合肽聚糖
7.5 His_6-NlpDN22能在体外增强HiS6-AmiC1_(LN32)降解肽聚糖的活性
7.6 AmiC1及其激活子NlpD影响致病性的机制研究
7.6.1 NlpD/EnvC/AmiC不影响Ⅲ型分泌系统hrp基因的表达
7.6.2 NlpD/AmiC1影响Ⅲ型效应物XC3176的分泌
7.7 小结
第八章 结论与讨论
8.1 Xcc的AmiC/NlpD/EnvC参与细胞分裂
8.2 Xcc的AmiC1/NlpD参与致病性
8.3 Xcc的AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族调控蛋白NlpD的激活
8.4 AmiC1/NlpD影响Xcc的Ⅲ型分泌系统,但不影响Ⅱ分泌系统
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表论文情况
本文编号：3679464
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