杀草丹降解菌株Acidovorax sp. T1的分离鉴定、降解途径及关键酶基因克隆

发布时间：2022-09-18 18:20

　　杀草丹（S-（4-氯苄基）N,N-二乙基硫代氨基甲酸酯）是一种高效,广谱和高选择性的硫代氨基甲酸酯类除草剂,能够有效的防治禾本科杂草与部分阔叶杂草,因对水稻田中稗草和牛毛草的防除具有特效,在世界范围内广泛用作稻田除稗剂。杀草丹对水生生物,两栖动物和无脊椎动物高毒,土壤中杀草丹残留对藻类和微生物的群落结构也有较大影响。已有研究表明在空气,土壤,河流与生物体中均能检测到杀草丹的存在。微生物降解是环境中杀草丹降解的主要因素,然而目前关于杀草丹降解菌的报道还十分有限,而且对杀草丹的纯培养微生物水平上的代谢途径及相关的降解酶和基因的研究仍未报道。因此分离筛选杀草丹高效降解菌株,从菌体,基因和酶学水平上研究杀草丹的微生物降解机制对于阐明杀草丹在环境中的降解转化等行为及对杀草丹所污染环境的微生物修复具有重要意义。本研究利用微生物富集驯化技术从活性污泥中分离到一株杀草丹高效降解菌株T1,并对其降解特性进行了研究。利用高效液相色谱（HPLC）和气质联用（GC-MS）检测方法鉴定到两个杀草丹降解中间代谢产物。在培养过程中筛选到一株失去杀草丹降解能力的T1突变菌株（T1m）。通过对野生株和突变株全基因组序列... 

【文章页数】：165 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号与缩略语说明
前言
第一章 文献综述
    第一节 杀草丹概述
        1 杀草丹简介
        2 杀草丹的使用方法与除草机制
        3 杀草丹残留对环境的危害
    第二节 杀草丹降解的研究进展
        1 杀草丹在环境中的降解方式
            1.1 光化学降解
            1.2 杀草丹在动植物中的降解
            1.3 杀草丹在土壤中的降解
        2 杀草丹降解菌的研究进展
        3 杀草丹降解酶的研究进展
    第三节 黄素依赖型单加氧酶概述
        1 黄素依赖型单加氧酶的分类
        2 C类FMN依赖型单加氧酶家族
            2.1 C或S原子加氧氧化
            2.2 苯环羟基化反应与脱氢氧化
            2.3 C-N/C-S键断键氧化
            2.4 C类黄素依赖型单加氧酶的催化机制
    第四节 本论文的研究目的和意义
第二章 杀草丹降解菌株的分离鉴定及降解途径研究
    第一节 杀草丹降解菌株的分离和鉴定
        1 材料与方法
            1.1 试剂与培养基
            1.2 杀草丹含量的测定
            1.3 杀草丹降解菌的富集,筛选与纯化
            1.4 菌株形态和生理生化特性的鉴定
            1.5 降解菌株16S rRNA基因序列分析
        2 结果与分析
            2.1 杀草丹降解菌株的筛选、分离与纯化
            2.2 突变菌株T1m的筛选
            2.3 杀草丹降解菌株T1的初步鉴定
            2.4 菌株BUT-10的鉴定
    第二节 菌株T1对杀草丹降解特性的研究
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 降解菌株T1菌悬液的制备
            1.3 温度和pH对菌株T1降解杀草丹的影响
            1.4 接种量对菌株T1降解杀草丹的影响
            1.5 杀草丹初始浓度对菌株T1降解杀草丹的影响
            1.6 菌株T1对其他硫代氨基甲酸酯类除草剂的降解
        2 结果与分析
            2.1 温度和pH对菌株T1降解杀草丹的影响
            2.2 菌体接种量对T1降解杀草丹的影响
            2.3 杀草丹的初始浓度对菌株T1降解杀草丹的影响
            2.4 菌株T1对其他硫代氨基甲酸酯类除草剂的降解
    第三节 菌株T1降解杀草丹的代谢产物鉴定及代谢途径预测
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 菌株T1菌悬液的制备
            1.3 菌株T1生长与杀草丹降解关系的探究
            1.4 菌株T1降解杀草丹中间代谢产物的质谱鉴定
            1.5 菌株T1及其突变株T1m的底物利用情况
        2 结果与分析
            2.1 菌株T1降解杀草丹与其生长的关系
            2.2 杀草丹降解中间代谢产物鉴定与代谢途径预测
            2.3 菌株T1和突变株T1m的降解底物谱
    本章讨论
    本章小结
第三章 杀草丹单加氧酶基因tmoAB的克隆与鉴定
    第一节 菌株T1和突变株T1m的全基因组测序与比对分析
        1 材料和方法
            1.1 培养基、试剂与供试菌株
            1.2 菌株基因组DNA的提取
            1.3 野生株T1及突变株T1m基因组测序
        2 结果与分析
            2.1 基因组DNA的提取和检测
            2.2 野生株T1基因组完成图的测序和组装
            2.3 突变株T1m基因组框架图的测序和组装
            2.4 全基因组比对与突变株T1m丢失基因片段的查找,鉴定和分析
    第二节 杀草丹降解关键基因tmoAB的克隆与功能鉴定
        1 材料和方法
            1.1 培养基,试剂与供试菌株
            1.2 菌株、质粒和引物
            1.4 杀草丹降解基因簇的功能验证
            1.5 杀草丹诱导条件下菌株T1中基因tmoAB的转录水平分析
        2 结果与分析
            2.1 突变株T1m质粒3中丢失基因片段的ORF分析
            2.2 重组菌株的杀草丹降解功能验证
            2.3 杀草丹降解基因tmoAB在杀草丹诱导下的转录水平分析
    第三节 杀草丹单加氧酶TmoAB的表达,纯化与酶学特性研究
        1 材料与方法
            1.1 菌株与试剂
            1.2 菌株、质粒和引物
            1.3 杀草丹单加氧酶基因tmoA和tmoB表达载体的构建
            1.4 TmoA和TmoB的诱导与表达
            1.5 目标蛋白TmoA和TmoB的纯化
            1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
            1.7 蛋白透析与保存
            1.8 TmoAB的杀草丹降解功能及降解产物鉴定
            1.9 杀草丹单加氧酶TmoAB酶学特性研究
            1.10 TmoA和TmoB的最佳摩尔浓度比例测定
            1.11 TmoAB和TmoB动力学参数的测定
            1.12 TmoAB的底物特异性
        2 结果与分析
            2.1 TmoA和TmoB的异源高效表达与纯化
            2.2 杀草丹单加氧酶TmoAB的体外功能验证
            2.3 杀草丹单加氧酶TmoAB的酶学特性研究
    本章讨论
    本章小结
第四章 杀草丹下游代谢产物降解基因的克隆与功能验证
    第一节 对氯苯甲醛脱氢酶基因tmoC的克隆与鉴定
        1 材料与方法
            1.1 培养基与试剂
            1.2 菌株、质粒和引物
            1.3 对氯苯甲醛脱氢酶基因tmoC表达载体的构建
            1.4 TmoC的诱导与表达
            1.5 目标蛋白TmoC的纯化、SDS-PAGE、透析和保存
            1.6 TmoC的功能鉴定
            1.7 TmoC动力学参数的测定
        2 结果与分析
            2.1 对氯苯甲醛脱氢酶基因tmoC的克隆
            2.2 TmoC的异源表达与纯化
            2.3 对氯苯甲醛脱氢酶TmoC的功能验证
            2.4 对氯苯甲醛脱氢酶TmoC的动力学参数
    第二节 对氯苯甲酸降解基因簇的克隆与转录分析
        1 材料与方法
            1.1 培养基,试剂与供试菌株
            1.2 实时荧光定量PCR所用引物
            1.3 菌株T1中杀草丹下游产物降解基因的转录水平分析
        2 结果与分析
    本章讨论
    本章小结
全文总结
研究创新点
研究展望
参考文献
附录
    附录一 培养基与试剂配方
    附录二 相关DNA序列
攻读博士学位期间发表的论文与申请的专利
致谢



本文编号：3680182