水稻齿叶矮缩病毒在褐飞虱复制增殖的分子机制研究
发布时间：2022-09-30 12:05
水稻齿叶矮缩病是由水稻齿叶矮缩病毒（rice ragged stunt virus,RRSV）引起的病害,它在水稻分蘖前期发病会引起稻株无法抽穗;分蘖后期发病会导致稻株生长速度减慢,抽穗不完全,谷粒不充实,严重影响稻米产量,是我国及其他东南亚国家一种重要的水稻病害。RRSV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）,水稻病毒属（Oryzavirus）,主要由水稻害虫褐飞虱以持久性增殖方式传播。RRSV含有10条dsRNA,共编码11种蛋白,包括8种结构蛋白和3种非结构蛋白。其中S10片段编码的蛋白Pns10,参与病毒复制工厂（病毒原质）的形成。有研究表明RRSV在Pns10缺失的情况下无法形成正常复制工厂,从而导致病毒复制、侵染、传播能力下降。研究Pns10与褐飞虱的蛋白互作,揭示病毒在侵染和复制过程中与宿主之间的相互作用机理,有助于防治水稻齿叶矮缩病。本研究利用酵母双杂交技术,成功构建了褐飞虱全虫的酵母文库,筛选出与Pns10 互作的 MD-2-related lipid-recognition protein（ML）、Sorting and assembly machinery co...
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 褐飞虱研究概况
1.1.1 褐飞虱及其危害
1.1.2 褐飞虱的防治
1.2 水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的研究进展
1.2.1 RRSV特征及分类
1.2.2 RRSV寄主及传播介体
1.2.3 RRSV基因组及编码蛋白
1.3 酵母双杂交系统在研究中的应用
1.3.1 酵母双杂交系统的原理
1.3.2 酵母双杂交系统的优缺点
1.3.3 酵母双杂交系统在病毒学中的应用
1.4 GST pull-down技术研究进展
1.5 研究的目的及科学意义
第二章 酵母双杂交文库构建
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.1.1 褐飞虱
2.2.1.2 酵母双杂交载体及菌株
2.2.1.3 主要实验试剂与工具
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 褐飞虱总RNA提取及鉴定
2.2.2.2 cDNA的第一条链合成
2.2.2.3 cDNA的第二条链合成
2.2.2.4 双链cDNA的柱纯化
2.2.2.5 Y187酵母感受态细胞的制备
2.2.2.6 酵母感受态转化及文库收集
2.3 结果与分析
2.3.1 酵母双杂交文库双链cDNA的合成与纯化
2.3.2 酵母双杂交文库转化
2.3.3 酵母双杂交文库收集
2.4 讨论
第三章 利用RRSV Pns10筛选褐飞虱全虫文库
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.1.1 RRSV病毒
3.2.1.2 酵母双杂交载体及菌株
3.2.1.3 主要实验试剂与工具
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 cDNA的合成
3.2.2.2 目的基因克隆与连接
3.2.2.3 重组质粒转化Y2H Gold菌株
3.2.2.4 诱饵菌株检测毒性和自激活效应
3.2.2.5 诱饵菌株筛选酵母cDNA文库
3.2.2.6 候选互作蛋白鉴定
3.2.2.7 生物信息学分析
3.3 结果与分析
3.3.1 诱饵载体构建
3.3.2 诱饵毒性与自激活检测
3.3.3 褐飞虱与RRSV Pns10互作蛋白的筛选
3.3.4 阳性克隆鉴定
3.3.5 候选互作蛋白的生物信息学分析
3.4 讨论
第四章 NlML与Pns10互作验证
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.1.1 原核表达载体及菌株
4.2.1.2 主要实验试剂与工具
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 序列全长获取
4.2.2.2 NlML基因原核表达载体的构建
4.2.2.3 NlML诱导表达
4.2.2.4 Western blotting验证蛋白表达
4.2.2.5 NlML融合蛋白大量表达及回收纯化
4.2.2.6 GST pull-down
4.3 结果与分析
4.3.1 NlML序列分析
4.3.2 原核表达载体构建
4.3.3 诱导表达
4.3.4 NlML回收及抗体制备
4.3.5 GST pull-down
4.4 讨论
第五章 NlML功能分析
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.2.2.1 NlML表达模式分析
5.2.2.2 实时荧光定量PCR
5.2.2.3 RNA干扰
5.2.2.3.1 双链RNA合成
5.2.2.3.2 显微注射dsRNA
5.2.2.4 带毒褐飞虱病毒量测定
5.3 结果与分析
5.3.1 NlML表达模式分析
5.3.2 RNA干扰效果
5.3.3 NlML与病毒复制增殖
5.4 讨论
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
在读期问发表的论文
致谢
本文编号：3683521
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 褐飞虱研究概况
1.1.1 褐飞虱及其危害
1.1.2 褐飞虱的防治
1.2 水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的研究进展
1.2.1 RRSV特征及分类
1.2.2 RRSV寄主及传播介体
1.2.3 RRSV基因组及编码蛋白
1.3 酵母双杂交系统在研究中的应用
1.3.1 酵母双杂交系统的原理
1.3.2 酵母双杂交系统的优缺点
1.3.3 酵母双杂交系统在病毒学中的应用
1.4 GST pull-down技术研究进展
1.5 研究的目的及科学意义
第二章 酵母双杂交文库构建
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.1.1 褐飞虱
2.2.1.2 酵母双杂交载体及菌株
2.2.1.3 主要实验试剂与工具
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 褐飞虱总RNA提取及鉴定
2.2.2.2 cDNA的第一条链合成
2.2.2.3 cDNA的第二条链合成
2.2.2.4 双链cDNA的柱纯化
2.2.2.5 Y187酵母感受态细胞的制备
2.2.2.6 酵母感受态转化及文库收集
2.3 结果与分析
2.3.1 酵母双杂交文库双链cDNA的合成与纯化
2.3.2 酵母双杂交文库转化
2.3.3 酵母双杂交文库收集
2.4 讨论
第三章 利用RRSV Pns10筛选褐飞虱全虫文库
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.1.1 RRSV病毒
3.2.1.2 酵母双杂交载体及菌株
3.2.1.3 主要实验试剂与工具
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 cDNA的合成
3.2.2.2 目的基因克隆与连接
3.2.2.3 重组质粒转化Y2H Gold菌株
3.2.2.4 诱饵菌株检测毒性和自激活效应
3.2.2.5 诱饵菌株筛选酵母cDNA文库
3.2.2.6 候选互作蛋白鉴定
3.2.2.7 生物信息学分析
3.3 结果与分析
3.3.1 诱饵载体构建
3.3.2 诱饵毒性与自激活检测
3.3.3 褐飞虱与RRSV Pns10互作蛋白的筛选
3.3.4 阳性克隆鉴定
3.3.5 候选互作蛋白的生物信息学分析
3.4 讨论
第四章 NlML与Pns10互作验证
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.1.1 原核表达载体及菌株
4.2.1.2 主要实验试剂与工具
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 序列全长获取
4.2.2.2 NlML基因原核表达载体的构建
4.2.2.3 NlML诱导表达
4.2.2.4 Western blotting验证蛋白表达
4.2.2.5 NlML融合蛋白大量表达及回收纯化
4.2.2.6 GST pull-down
4.3 结果与分析
4.3.1 NlML序列分析
4.3.2 原核表达载体构建
4.3.3 诱导表达
4.3.4 NlML回收及抗体制备
4.3.5 GST pull-down
4.4 讨论
第五章 NlML功能分析
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.2.2.1 NlML表达模式分析
5.2.2.2 实时荧光定量PCR
5.2.2.3 RNA干扰
5.2.2.3.1 双链RNA合成
5.2.2.3.2 显微注射dsRNA
5.2.2.4 带毒褐飞虱病毒量测定
5.3 结果与分析
5.3.1 NlML表达模式分析
5.3.2 RNA干扰效果
5.3.3 NlML与病毒复制增殖
5.4 讨论
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
在读期问发表的论文
致谢
本文编号：3683521
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