葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白的鉴定与功能研究

发布时间：2022-10-11 16:46

　　葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae（Fitch）属于半翅目Hemiptera根瘤蚜科Phylloxeridae,是为害我国葡萄生产的重要检疫性害虫,其幼虫和成虫均可吸取寄主植物汁液,形成叶瘿和根瘤。目前在我国主要以根瘤型危害为主,危害发生时可造成葡萄根系腐烂,严重时甚至死亡。对于生活在土壤中的葡萄根瘤蚜,嗅觉在其寻找和定位寄主过程中发挥着重要作用,而嗅觉相关蛋白参与昆虫外围嗅觉活动,是昆虫嗅觉活动的分子基础。因此,对葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白基因进行鉴定和功能解析有助于掌握昆虫嗅觉识别的分子机制,也可为进一步研究害虫嗅觉干扰和生物防治提供理论依据。本研究通过分析葡萄根瘤蚜转录组,鉴定获得了27个葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因,并对其进行了序列分析和基因克隆。并在此基础上对葡萄根瘤蚜头部高表达的气味结合蛋白和化学感受蛋白进行了原核表达、蛋白纯化、荧光竞争结合和免疫荧光定位研究,得到主要研究结果如下:1、葡萄根瘤蚜触角、口器超微结构观察及感器鉴定为了揭示嗅觉相关蛋白在感器中的定位,通过扫描电镜对该虫触角和口器超微结构进行观察,结果显示:触角柄节着生2个毛形感器,梗节着生2个毛... 

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 昆虫的嗅觉识别系统及感受识别机制
        1.1.1 昆虫的嗅觉识别系统
        1.1.2 感受气味分子的机制
        1.1.3 气味分子
    1.2 昆虫嗅觉相关蛋白
        1.2.1 气味结合蛋白
        1.2.2 化学感受蛋白
        1.2.3 气味受体
        1.2.4 感觉神经元膜蛋白
        1.2.5 气味降解酶
    1.3 葡萄根瘤蚜
        1.3.1 葡萄根瘤蚜研究现状
        1.3.2 本研究的目的和意义
第二章 葡萄根瘤蚜触角和口器超微结构观察
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 扫描电镜观察
    2.2 结果与分析
        2.2.1 葡萄根瘤蚜触角和口器的整体形态
        2.2.2 葡萄根瘤蚜触角和口器感器
    2.3 结论与讨论
第三章 葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因的鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 供试昆虫
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 总RNA提取及cDNA第一链的合成
        3.1.5 葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因的鉴定与序列分析
        3.1.6 系统发育树的构建与分析
        3.1.7 组织分布研究
        3.1.8 开放阅读框全长基因的验证
    3.2 结果与分析
        3.2.1 DviOBPs的鉴定、系统发育分析及组织分布研究
        3.2.2 DviCSPs的鉴定、系统发育分析及组织分布研究
        3.2.3 DviORs的鉴定、系统发育分析及组织分布研究
        3.2.4 DviSNMP1的鉴定、系统发育分析及组织分布研究
        3.2.5 DviGSTs的鉴定、系统发育分析及组织分布研究
    3.3 结论与讨论
第四章 葡萄根瘤蚜寄主植物挥发物的测定
    4.1 材料和方法
        4.1.1 供试葡萄根段
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 实验方法
    4.2 结果与分析
    4.3 结论与讨论
第五章 葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白的原核表达与纯化
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试昆虫
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 缓冲液配制
        5.1.4 主要仪器
        5.1.5 目的蛋白ORF的扩增和纯化
        5.1.6 克隆载体的连接与转化
        5.1.7 质粒双酶切与表达载体的构建
        5.1.8 重组蛋白的原核表达
        5.1.9 重组蛋白的纯化
        5.1.10 蛋白浓度测定
    5.2 结果与分析
        5.2.1 DviOBPs和DviCSPs的扩增、纯化及转化
        5.2.2 重组质粒及pET28a(+)双酶切鉴定
        5.2.3 蛋白表达菌的转化
        5.2.4 蛋白诱导表达
        5.2.5 蛋白浓度测定
    5.3 结论与讨论
第六章 DviCSP2和DviCSP5的结合特性
    6.1 材料与方法
        6.1.1 蛋白样品
        6.1.2 主要试剂
        6.1.3 缓冲液的配制
        6.1.4 主要仪器
        6.1.5 蛋白样品与1-NPN的结合常数测定
        6.1.6 气味标样的荧光竞争结合实验
    6.2 结果与分析
        6.2.1 重组蛋白与1-NPN的结合常数测定
        6.2.2 重组蛋白与气味标样的竞争结合实验
    6.3 结论与讨论
第七章 葡萄根瘤蚜DviCSP5的免疫荧光定位
    7.1 材料与方法
        7.1.1 供试动物
        7.1.2 主要试剂
        7.1.3 缓冲液配制
        7.1.4 主要仪器
        7.1.5 原核表达载体的构建、蛋白质的纯化、透析及蛋白浓度测定
        7.1.6 多克隆抗体的制备
        7.1.7 抗体效价检测
        7.1.8 Westernblot检测多克隆抗体的特异性
        7.1.9 葡萄根瘤蚜DviCSP5的免疫荧光定位
    7.2 结果与分析
        7.2.1 抗体效价检测
        7.2.2 DviCSP5免疫荧光定位
    7.3 结论与讨论
第八章 结论与展望
    8.1 结论
    8.2 展望
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位[J]. 李文海,黄兴龙,王敦,冯纪年.  昆虫学报. 2015(10)
[2]Effects of intercropping vines with tobacco and root extracts of tobacco on grape phylloxera, Daktulosphaira vitifoliae Fitch[J]. WANG Zhong-yue,SU Jun-ping,LIU Wei-wei,GUO Yu-yuan.  Journal of Integrative Agriculture. 2015(07)
[3]松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究[J]. 钱凯,冯波,巫诩亮,劳冲,沈幼莲,杜永均.  昆虫学报. 2015(05)
[4]刺桐姬小蜂雌成虫对寄主植物挥发物的嗅觉行为反应[J]. 李军,梁广文,郭强,蒋露,戴建青,韩诗畴.  华南农业大学学报. 2014(01)
[5]光肩星天牛对植物源挥发物的触角电位和行为反应[J]. 范丽清,严善春,孙宗华,孟昭君.  生态学杂志. 2013(01)
[6]蚜虫触角感受器结构及功能研究进展[J]. 赵立静,班丽萍.  应用昆虫学报. 2011(04)
[7]根瘤蚜对不同抗性葡萄的选择性及葡萄根系挥发性物质的鉴定[J]. 杜远鹏,郑秋玲,翟衡,蒋恩顺,王忠跃.  昆虫学报. 2009(05)
[8]松脂单萜类物质与油松对红脂大小蠹抗性的关系[J]. 贾洪敏,黄大庄,曹逸霞,孔祥波,张真.  东北林业大学学报. 2008(01)
[9]部分葡萄品种和砧木抗葡萄根瘤蚜性能鉴定[J]. 杜远鹏,王兆顺,孙庆华,翟衡,王忠跃.  昆虫学报. 2008(01)
[10]昆虫气味受体研究进展[J]. 乔奇,原国辉,李海超,郭线茹,罗梅浩.  昆虫学报. 2008(01)

博士论文
[1]梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制[D]. 李广伟.西北农林科技大学 2016
[2]棉铃虫嗅觉相关蛋白的鉴定及功能研究[D]. 张天涛.西北农林科技大学 2011

硕士论文
[1]蚜总科昆虫口器的比较形态学研究（昆虫纲：半翅目）[D]. 葛孚瑢.西北农林科技大学 2016
[2]茄无网蚜气味结合蛋白OBP7的克隆、表达谱及其触角和腹管超微结构观察[D]. 赵雪.东北农业大学 2014



本文编号：3690929