棘孢木霉木聚糖酶诱导山新杨系统抗病性机制
发布时间：2022-12-04 07:28
木霉菌（Trichoderma spp.）是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌,生防潜力巨大,被广泛应用于农业和林业。对其生防机制进行了深入的研究。木霉菌不仅能抑制病原真菌,还能直接作用于寄主植物,刺激寄主植物对病原真菌产生系统抗病性。棘孢木霉分泌的木聚糖酶属于糖基水解酶家族11（Glycosyl hydrolases family 11,GH11）,能够刺激寄主植物对病原真菌产生系统抗病性,被称为新型植物诱导剂,具有很高的科研价值和广阔的开发前景。在本研究中,克隆获得棘孢木霉ACCC30536菌株的GH11家族中4个木聚糖酶基因（Xyn）。Xyn29.4有1个内含子,有282aa,等电点为5.51,蛋白分子量为29.4kDa;Xyn24.2有1个内含子,有223 aa,等电点为6.82,蛋白分子量为24.2kDa;Xyn24.4有1个内含子,有230 aa,等电点为5.00,蛋白分子量为24.4 kDa;Xyn24.1有2个内含子,有225 aa,等电点为5.25,蛋白分子量为24.1 kDa。基因结构方面,GH11家族的所有Xyn基因可以分成4类,分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ类,每类中的...
【文章页数】：127 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 木霉的研究概况
1.1.1 木霉分类地位及特点
1.1.2 木霉促进植物生长
1.1.3 木霉与植物互作方式
1.1.4 木霉诱导植物产生抗病性机制
1.2 木聚糖酶的研究概况
1.2.1 木聚糖酶基本性质
1.2.2 木聚糖酶的分类
1.2.3 木聚糖酶的催化机制
1.2.4 木聚糖酶诱导植物抗病性的研究
1.3 毕赤酵母表达系统的研究概况
1.4 山新杨的研究概况
1.5 本文研究目的和意义
1.6 研究内容与技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
2 棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族基因功能研究
2.1 试验材料
2.1.1 供试试剂
2.1.2 仪器及材料
2.1.3 供试菌株和植物材料
2.1.4 培养基
2.2 研究方法
2.2.1 棘孢木霉基因组木聚糖酶家族的生物信息学分析
2.2.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因表达特性研究
2.3 结果与分析
2.3.1 木霉的木聚糖酶家族生物信息学分析
2.3.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因的表达特性研究
2.3.3 互作后木霉分生孢子RNA的提取
2.4 关于棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族的基因功能研究的讨论
2.4.1 木聚糖酶家族的基因特性
2.4.2 木聚糖酶家族的基因结构特性
2.4.3 木聚糖酶家族的蛋白结构特性
2.4.4 木霉与山新杨互作后提取木霉分生孢子RNA
2.4.5 与山新杨互作后木霉的GH11家族的Xyn基因表达变化规律
2.5 本章小结
3 GH11家族木聚糖酶基因Xyn29.4和Xyn24.2酵母表达
3.1 试验材料
3.1.1 供试菌株及载体
3.1.2 供试试剂
3.1.3 培养基
3.2 试验方法
3.2.1真核表达载体的选择
3.2.2 pPIC9K质粒的提取
3.2.3 木聚糖酶Xyn29.4和Xyn24.2基因的扩增
3.2.4 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的构建
3.2.5 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的检测及保存
3.2.6 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2转化毕赤酵母GS115
3.2.7 酵母重组转化子GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的诱导表达
3.2.8 真核重组酶rXyn29.4和rXyn24.2的特性分析
3.3 试验结果
3.3.1 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的构建及鉴定
3.3.2 重组表达质粒pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2转化毕赤酵母GS115及筛选
3.3.3 酵母重组转化菌株GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的诱导表达及纯化
3.3.4 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2的酶活检测
3.4 关于Ⅰ型木聚糖酶和Ⅱ型木聚糖酶的真核表达的讨论
3.4.1 选择毕赤酵母表达系统
3.4.2 构建木聚糖酶毕赤酵母工程菌株
3.4.3 工程菌株分泌的重组木聚糖酶的SDS-PAGE电泳检测
3.4.4 工程菌株分泌的重组木聚糖酶的酶活性检测
3.5 本章小结
4 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2促进山新杨生长特性
4.1 试验材料
4.1.1 供试植物材料
4.1.2 供试试剂
4.1.3 供试仪器
4.2 试验方法
4.2.1 重组木聚糖酶诱导山新杨组培苗
4.2.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨的生长指标
4.2.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨激素转导途径相关基因的RT-qPCR
4.2.4 重组木聚糖酶诱导后山新杨的生理酶活性测定
4.2.5 重组木聚糖酶诱导后山新杨的活性氧,细胞膜透性检测
4.3 实验结果
4.3.2 重组木聚糖酶对山新杨激素转导途径相关基因的影响
4.3.3 重组木聚糖酶促进山新杨的生长
4.3.4 重组木聚糖酶提高杨树防御酶活性
4.3.5 重组木聚糖酶增强山新杨叶片的抗活性氧能力以及细胞膜抗性
4.4 关于重组木聚糖酶提高山新杨生理生长指标的讨论
4.4.1 重组木聚糖酶诱导的山新杨激素转导途径相关基因转录模式有明显的变化
4.4.2 重组木聚糖酶诱导的山新杨生长量增加
4.4.3 重组木聚糖酶诱导的山新杨防御酶活性增加
4.4.4 重组木聚糖酶诱导增强山新杨叶片的抗活性氧能力以及细胞膜抗性
4.5 本章小结
5 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2诱导山新杨系统抗病性
5.1 试验材料
5.1.1 组培苗及菌种
5.1.2 供试试剂
5.1.3 培养基
5.1.4 供试仪器
5.2 试验方法
5.2.1 重组木聚糖酶诱导山新杨土培苗
5.2.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨的离体叶片接种叶枯病病原链格孢菌
5.2.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨的整株接种立枯丝核菌和尖孢镰刀菌
5.2.4 高效液相色谱法(HPLC)测定重组木聚糖酶诱导后山新杨叶部茉莉酸含量
5.2.5 木聚糖通过茉莉酸途径局部诱导山新杨抗尖孢镰刀菌
5.3 试验结果
5.3.1 重组木聚糖酶诱导后山新杨离体叶片接种叶枯病病原链格孢菌
5.3.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨整株接种立枯丝核菌和尖孢镰刀菌
5.3.3 山新杨叶片中茉莉酸含量变化
5.3.4 重组木聚糖酶局部诱导山新杨系统抗病性
5.3.5 重组木聚糖酶通过茉莉酸途径诱导山新杨系统抗病性
5.3.6 重组木聚糖酶诱导山新杨系统抗病性机制模式图
5.4 关于对重组木聚糖酶诱导山新杨产生系统抗病性的讨论
5.4.1 重组木聚糖酶诱导增强山新杨抗叶枯病病原链格孢菌能力
5.4.2 重组木聚糖酶诱导增强山新杨抗立枯丝核菌和尖孢镰刀菌能力
5.4.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨茉莉酸变化
5.4.4 利用分根系统研究重组木聚糖酶局部或系统诱导山新杨抗病性
5.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件
本文编号：3707841
【文章页数】：127 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 木霉的研究概况
1.1.1 木霉分类地位及特点
1.1.2 木霉促进植物生长
1.1.3 木霉与植物互作方式
1.1.4 木霉诱导植物产生抗病性机制
1.2 木聚糖酶的研究概况
1.2.1 木聚糖酶基本性质
1.2.2 木聚糖酶的分类
1.2.3 木聚糖酶的催化机制
1.2.4 木聚糖酶诱导植物抗病性的研究
1.3 毕赤酵母表达系统的研究概况
1.4 山新杨的研究概况
1.5 本文研究目的和意义
1.6 研究内容与技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
2 棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族基因功能研究
2.1 试验材料
2.1.1 供试试剂
2.1.2 仪器及材料
2.1.3 供试菌株和植物材料
2.1.4 培养基
2.2 研究方法
2.2.1 棘孢木霉基因组木聚糖酶家族的生物信息学分析
2.2.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因表达特性研究
2.3 结果与分析
2.3.1 木霉的木聚糖酶家族生物信息学分析
2.3.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因的表达特性研究
2.3.3 互作后木霉分生孢子RNA的提取
2.4 关于棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族的基因功能研究的讨论
2.4.1 木聚糖酶家族的基因特性
2.4.2 木聚糖酶家族的基因结构特性
2.4.3 木聚糖酶家族的蛋白结构特性
2.4.4 木霉与山新杨互作后提取木霉分生孢子RNA
2.4.5 与山新杨互作后木霉的GH11家族的Xyn基因表达变化规律
2.5 本章小结
3 GH11家族木聚糖酶基因Xyn29.4和Xyn24.2酵母表达
3.1 试验材料
3.1.1 供试菌株及载体
3.1.2 供试试剂
3.1.3 培养基
3.2 试验方法
3.2.1真核表达载体的选择
3.2.2 pPIC9K质粒的提取
3.2.3 木聚糖酶Xyn29.4和Xyn24.2基因的扩增
3.2.4 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的构建
3.2.5 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的检测及保存
3.2.6 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2转化毕赤酵母GS115
3.2.7 酵母重组转化子GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的诱导表达
3.2.8 真核重组酶rXyn29.4和rXyn24.2的特性分析
3.3 试验结果
3.3.1 重组表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的构建及鉴定
3.3.2 重组表达质粒pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2转化毕赤酵母GS115及筛选
3.3.3 酵母重组转化菌株GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的诱导表达及纯化
3.3.4 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2的酶活检测
3.4 关于Ⅰ型木聚糖酶和Ⅱ型木聚糖酶的真核表达的讨论
3.4.1 选择毕赤酵母表达系统
3.4.2 构建木聚糖酶毕赤酵母工程菌株
3.4.3 工程菌株分泌的重组木聚糖酶的SDS-PAGE电泳检测
3.4.4 工程菌株分泌的重组木聚糖酶的酶活性检测
3.5 本章小结
4 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2促进山新杨生长特性
4.1 试验材料
4.1.1 供试植物材料
4.1.2 供试试剂
4.1.3 供试仪器
4.2 试验方法
4.2.1 重组木聚糖酶诱导山新杨组培苗
4.2.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨的生长指标
4.2.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨激素转导途径相关基因的RT-qPCR
4.2.4 重组木聚糖酶诱导后山新杨的生理酶活性测定
4.2.5 重组木聚糖酶诱导后山新杨的活性氧,细胞膜透性检测
4.3 实验结果
4.3.2 重组木聚糖酶对山新杨激素转导途径相关基因的影响
4.3.3 重组木聚糖酶促进山新杨的生长
4.3.4 重组木聚糖酶提高杨树防御酶活性
4.3.5 重组木聚糖酶增强山新杨叶片的抗活性氧能力以及细胞膜抗性
4.4 关于重组木聚糖酶提高山新杨生理生长指标的讨论
4.4.1 重组木聚糖酶诱导的山新杨激素转导途径相关基因转录模式有明显的变化
4.4.2 重组木聚糖酶诱导的山新杨生长量增加
4.4.3 重组木聚糖酶诱导的山新杨防御酶活性增加
4.4.4 重组木聚糖酶诱导增强山新杨叶片的抗活性氧能力以及细胞膜抗性
4.5 本章小结
5 重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2诱导山新杨系统抗病性
5.1 试验材料
5.1.1 组培苗及菌种
5.1.2 供试试剂
5.1.3 培养基
5.1.4 供试仪器
5.2 试验方法
5.2.1 重组木聚糖酶诱导山新杨土培苗
5.2.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨的离体叶片接种叶枯病病原链格孢菌
5.2.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨的整株接种立枯丝核菌和尖孢镰刀菌
5.2.4 高效液相色谱法(HPLC)测定重组木聚糖酶诱导后山新杨叶部茉莉酸含量
5.2.5 木聚糖通过茉莉酸途径局部诱导山新杨抗尖孢镰刀菌
5.3 试验结果
5.3.1 重组木聚糖酶诱导后山新杨离体叶片接种叶枯病病原链格孢菌
5.3.2 重组木聚糖酶诱导后山新杨整株接种立枯丝核菌和尖孢镰刀菌
5.3.3 山新杨叶片中茉莉酸含量变化
5.3.4 重组木聚糖酶局部诱导山新杨系统抗病性
5.3.5 重组木聚糖酶通过茉莉酸途径诱导山新杨系统抗病性
5.3.6 重组木聚糖酶诱导山新杨系统抗病性机制模式图
5.4 关于对重组木聚糖酶诱导山新杨产生系统抗病性的讨论
5.4.1 重组木聚糖酶诱导增强山新杨抗叶枯病病原链格孢菌能力
5.4.2 重组木聚糖酶诱导增强山新杨抗立枯丝核菌和尖孢镰刀菌能力
5.4.3 重组木聚糖酶诱导后山新杨茉莉酸变化
5.4.4 利用分根系统研究重组木聚糖酶局部或系统诱导山新杨抗病性
5.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
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