可可毛色二孢菌效应子LtCre1在葡萄中的互作靶标筛选

发布时间：2022-12-08 22:21

　　葡萄（Vitis vinifera L.）是一种营养价值极高的经济型水果,深受人们的喜爱。但葡萄易受病原真菌的侵染而发生病害,严重影响葡萄的品质和产量。由葡萄座腔菌科真菌引发的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）是危害葡萄产业发展的重要病害,其中可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）是造成该病害的主要病原真菌之一。效应子（effector）是病原菌与植物互作过程中分泌的可以改变寄主细胞结构和功能的蛋白分子,使病原菌容易定殖在寄主植物中发挥作用,但目前对L.theobromae效应子的蛋白功能研究报道较少。旨在揭示L.theobromae对寄主葡萄的致病性,为植物病害的防治和抗病品种的选育提供思路,本文主要探究由L.theobromae释放的有重要调控作用的效应子LtCre1对葡萄的作用机理和L.theobromae特有效应子LT₃97受逆境胁迫下的基因转录水平。主要研究结果如下:（1）利用酵母双杂交技术预筛选L.theobromae效应子LtCre1与葡萄cDNA文库互作的候选蛋白,共有210余个候选蛋白既与效应子... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 葡萄溃疡病与可可毛色二孢菌的研究基础
    1.2 植物防御系统研究进展
        1.2.1 病原相关分子模式触发的免疫PTI
        1.2.2 效应子触发的免疫反应ETI
        1.2.3 效应子的作用机制
    1.3 病原菌-寄主的蛋白互作技术
        1.3.1 酵母双杂交技术
        1.3.2 双分子荧光互补实验技术
        1.3.3 Pull down技术
        1.3.4 免疫共沉淀技术
    1.4 可可毛色二孢菌效应子的研究进展
    1.5 本研究的目的与意义
2 酵母双杂交技术筛选可可毛色二孢菌效应子LtCre1与葡萄互作的靶标
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 供试培养基和其它试剂
        2.1.3 试验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 诱饵载体的构建
        2.2.2 酵母感受态制备
        2.2.3 诱饵载体质粒向酵母的小量转化
        2.2.4 酵母双杂交预筛选
        2.2.5 酵母质粒DNA的提取
        2.2.6 酵母质粒向大肠杆菌感受态的转化
        2.2.7 候选基因序列分析
        2.2.8 候选蛋白自激活验证
        2.2.9 候选蛋白回转验证
        2.2.10 候选互作基因全长的克隆与AD载体的构建
        2.2.11 候选全长蛋白自激活验证和回复验证
        2.2.12 候选蛋白亚细胞结构预测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 诱饵载体的验证
        2.3.2 诱饵载体的自激活及毒性分析
        2.3.3 酵母双杂交预筛选分析
        2.3.4 候选蛋白基因序列分析
        2.3.5 候选蛋白自激活验证
        2.3.6 候选蛋白回转验证
        2.3.7 候选互作基因AD载体的验证
        2.3.8 候选互作全长蛋白的自激活和回复验证
        2.3.9 候选互作蛋白亚细胞结构分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 效应子LtCre1寄主靶标的鉴定
    3.1 试验材料
        3.1.1 供试菌株和质粒
        3.1.2 植物材料
        3.1.3 试验试剂
    3.2 试验方法
        3.2.1 可可毛色二孢菌cDNA的制备
        3.2.2 葡萄cDNA的制备
        3.2.3 候选基因GFP载体的构建
        3.2.4 候选基因和效应基因LtCRE1 BiFC载体的构建
        3.2.5 农杆菌感受态的制备
        3.2.6 质粒转化农杆菌感受态
        3.2.7 农杆菌介导的注射接种
        3.2.8 效应基因LtCRE1原核表达载体构建
        3.2.9 候选基因EVvCIP2和VvCIP4 原核表达载体的构建
        3.2.10 目的蛋白小量诱导表达
        3.2.11 SDS聚丙稀酰胺电泳检测蛋白
    3.3 结果与分析
        3.3.1 候选基因GFP载体的验证
        3.3.2 候选基因和效应子基因BiFC载体的验证
        3.3.3 BiFC验证效应子LtCre1 与候选蛋白Vv CIP2和Vv CIP4 互作
        3.3.4 p GEX-LtCre1 原核表达质粒的鉴定
        3.3.5 候选蛋白原核表达质粒的鉴定
        3.3.6 SDS-PAGE分析重组蛋白的表达
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 可可毛色二孢菌效应子LT_397基因的克隆及转录分析
    4.1 试验材料
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 供试培养基和其它试剂
    4.2 试验方法
        4.2.1 效应子LT_397基因的克隆
        4.2.2 效应子LT_397的生物信息学分析
        4.2.3 效应子LT_397毒力测定
        4.2.4 逆境胁迫下处理L.theobromae菌丝
        4.2.5 q RT-PCR检测LT_397 基因的转录水平
    4.3 结果与分析
        4.3.1 LT_397基因的克隆及分析
        4.3.2 LT_397蛋白质的基本性质与功能分析
        4.3.3 效应子LT_397 可抑制B.glumae诱导的HR反应
        4.3.4 L.theobromae不同侵染时间的LT_397 转录分析
        4.3.5 LT_397受逆境胁迫诱导转录分析
    4.4 讨论
    4.5 小结
总结
展望
附录A 溶液配制
附录B 常见缩略词
附录C 载体图谱
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物病原菌效应子的研究进展[J]. 杨晓倩,张立春,李奕文,王延伟.  中国科学:生命科学. 2020(02)
[2]葡萄病害防治技术[J]. 刘海磊,刘建敏,刘国生,梁文凯,李卫东.  河北农业. 2020(01)
[3]葡萄溃疡病的发生危害及综防技术探究[J]. 张玉榕,迟文娟.  时代农机. 2018(10)
[4]葡萄主要病害及其防治[J]. 白凤珍.  现代农业科技. 2018(18)
[5]植物PTI天然免疫信号转导研究进展[J]. 杨俊,吕东平.  中国生态农业学报. 2018(10)
[6]葡萄病害综合防治技术[J]. 王延俊.  农业与技术. 2018(08)
[7]西藏一种芥菜型油菜PGIP基因的克隆与序列分析[J]. 庞博,刘何春.  植物保护. 2018(02)
[8]葡萄主要病害防治要点[J]. 李学军.  中国果菜. 2017(10)
[9]葡萄常见病害防治技术[J]. 赵庆久,明广增.  植物医生. 2017(06)
[10]尖孢镰刀菌番茄专化型中APSES转录因子FolStuA的功能分析[J]. 周欣,云英子,郭谱胜,吴凯莉,陈伟钟,李江江,周晓莉.  分子植物育种. 2018(03)

博士论文
[1]葡萄溃疡病菌侵染葡萄的组学基础与分子机制的初步研究[D]. 张玮.中国农业大学 2019

硕士论文
[1]中国葡萄主栽品种抗葡萄溃疡病的研究[D]. 姚晟伟.湖南农业大学 2011



本文编号：3714240