家蚕微孢子虫SAS-6蛋白定位及检测技术研究

发布时间：2023-01-03 10:45

　　微孢子虫是细胞内专性寄生的单细胞真核生物,能感染大部分脊椎、无脊椎动物,其中家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）第一个被鉴定出来。N.bombycis是引起家蚕微粒子病的主要病原,由于其能经食下和胚种传染,经常给蚕业生产带来巨大的经济损失,影响蚕丝产业的稳定,因此,N.bombycis被列为蚕种生产的唯一法定检疫对象。母蛾镜检N.bombycis的方法是目前最主要的检疫手段,但其准确性受到多种因素影响。因此,建立一种简便、高效的N.bombycis检测技术,对于防治家蚕微粒子病起到关键作用。本文首先对传统的荧光染色法进行优化,联合应用荧光增白剂28（FB28）和碘化丙啶（PI）2种荧光染色剂进行N.bombycis孢子检测。结果表明,成熟孢子被FB28染成蓝色且细胞核被PI染成红色,而未成熟的孢子只能被PI染色;在被感染的幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕中都能够检测到N.bombycis孢子的存在,并且带毒母蛾样品稀释1 000倍依然可以检测到N.bombycis孢子。荧光显微镜下显示被染色的N.bombycis孢子的细胞核明显小于幼虫中肠细胞核,且亮度明显较强,卵壳、母蛾、蚁蚕表... 

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 研究背景及意义
        1.1.1 研究背景
        1.1.2 研究意义
    1.2 微孢子虫研究进展
        1.2.1 微孢子虫的超微结构与生活史
        1.2.2 微孢子虫基因组学与蛋白质组学的研究进展
    1.3 微孢子虫检测技术研究进展
        1.3.1 染色法识别微孢子虫
        1.3.2 免疫学技术检测微孢子虫
        1.3.3 分子生物学技术检测微孢子虫
    1.4 纳米金比色法
        1.4.1 纳米金比色法检测Hg~（2+）
        1.4.2 纳米金比色法检测核酸物质
        1.4.3 纳米金比色法检测蛋白质
    1.5 SAS-6蛋白质研究进展
        1.5.1 SAS-6蛋白质结构研究
        1.5.2 SAS-6蛋白质功能研究
    1.6 研究内容
第2章 应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色识别家蚕微孢子虫
    2.1 实验材料
        2.1.1 病原物来源及供试家蚕品种
        2.1.2 感染幼虫中肠、母蛾、卵、蚁蚕的获取
        2.1.3 主要仪器和试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 幼虫中肠样品染色
        2.2.2 母蛾样品染色
        2.2.3 蚕卵样品染色
        2.2.4 蚁蚕样品染色
    2.3 结果与分析
        2.3.1 感染家蚕幼虫中肠的检测效果
        2.3.2 感染母蛾的检测效果
        2.3.3 感染蚕卵的检测效果
        2.3.4 感染蚁蚕的检测效果
    2.4 讨论
第3章 纳米金比色法与免疫技术结合检测家蚕微孢子虫
    3.1 实验材料
        3.1.1 微孢子虫
        3.1.2 主要仪器和试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 纳米金(AuNPs)制备
        3.2.2 家蚕微孢子虫总蛋白提取及其抗体制备
        3.2.3 抗体与AuNPs结合的最佳pH确定
        3.2.4 AuNPs与抗体结合的最佳浓度测定
        3.2.5 AuNPs探针制备
        3.2.6 纳米金探针活性及其特异性测定
        3.2.7 纳米金探针灵敏性测定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 AuNPs的制备
        3.3.2 N.bombycis总蛋白抗体制备
        3.3.3 最适标记pH和最适抗体量
        3.3.4 AuNPs探针活性及其特异性测定
        3.3.5 AuNPs比色法灵敏性测定
    3.4 讨论
第4章 纳米金比色法与LAMP技术结合检测家蚕微孢子虫
    4.1 实验材料
        4.1.1 蚕种
        4.1.2 微孢子虫、细菌、真菌和病毒
        4.1.3 主要仪器和试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 FTA法提取微孢子虫基因组
        4.2.2 PCR引物设计、反应体系与反应条件
        4.2.3 LAMP引物设计、反应体系及反应条件的优化
        4.2.4 纳米金制备
        4.2.5 AuNP探针制备
        4.2.6 AuNP与LAMP产物杂交条件优化
        4.2.7 比较LAMP-AuNP法和PCR法检测的灵敏度
        4.2.8 LAMP-AuNP法特异性分析
        4.2.9 LAMP-AuNP法与PCR法检测带毒蚕卵
    4.3 结果与分析
        4.3.1 LAMP反应温度优化
        4.3.2 LAMP反应时间优化
        4.3.3 LAMP反应引物特异性分析
        4.3.4 LAMP产物与AuNP探针杂交比例优化
        4.3.5 盐浓度对比色实验影响
        4.3.6 LAMP-AuNP和PCR法灵敏度比较
        4.3.7 LAMP-AuNP法特异性检测
        4.3.8 LAMP-AuNP法检测带毒蚕卵
    4.4 讨论
第5章 家蚕微孢子虫SAS-6蛋白鉴定及其定位研究
    5.1 实验材料
        5.1.1 家蚕微孢子虫
        5.1.2 主要仪器和试剂
    5.2 实验方法
        5.2.0 家蚕微孢子虫DNA提取
        5.2.1 家蚕微孢子虫SAS-6基因克隆
        5.2.2 NSAS-6蛋白氨基酸序列分析
        5.2.3 NSAS-6重组蛋白表达
        5.2.4 NSAS-6重组蛋白纯化
        5.2.5 Western blot鉴定NSAS-6重组蛋白
        5.2.6 多克隆抗体制备及其效价检测
        5.2.7 纯化N.bombycis孢子
        5.2.8 家蚕微孢子虫总蛋白及孢原质蛋白提取
        5.2.9 Western blot检测N.bombycis中NSAS-6蛋白
        5.2.10 N.bombycis接种BmN细胞
        5.2.11 NSAS-6蛋白亚细胞定位
    5.3 结果与分析
        5.3.1 NSAS-6基因克隆
        5.3.2 生物信息学分析
        5.3.3 NSAS-6重组蛋白表达及纯化
        5.3.4 NSAS-6蛋白免疫印迹分析
        5.3.5 NSAS-6蛋白免疫定位
    5.4 讨论
结论
参考文献
附录
攻读硕士期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增（LAMP）技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究[J]. 席伟军,陈大福,郭睿,李江红,梁勤,苏晓玲,赵东绪,华启云.  环境昆虫学报. 2017(01)
[2]应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色识别家蚕微孢子虫[J]. 戴卫江,陈功,彭祥然,李孝良,马琳,唐旭东,徐莉,沈中元.  蚕业科学. 2017(01)
[3]环介导等温扩增法检测熊蜂中的微孢子虫[J]. 郭礼强,韩亮,张丽萍,田国宁,赵晗.  中国动物检疫. 2017(01)
[4]单增李斯特菌胶体金免疫探针的制备[J]. 孟繁桐,王莹,葛怀娜,刘珊娜.  中国乳品工业. 2016(01)
[5]基于EB1基因的环介导等温扩增（LAMP）法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵[J]. 刘吉平,程伟,晏育伟,魏建影,杨吉龙.  昆虫学报. 2015(08)
[6]母蛾经高温干燥处理不同时间对体内家蚕微孢子虫的灭活效果[J]. 陈世良,杨荣贵,高建华,高翔,张金祥,朱峰.  蚕业科学. 2015(04)
[7]家蚕微孢子虫研究10年回眸[J]. 周泽扬,潘国庆,向仲怀.  蚕业科学. 2014(06)
[8]微孢子虫极管蛋白的研究进展[J]. 龙梦娴,吴玉娇,陈洁,潘国庆,李春峰,李田,陈果,周泽扬.  蚕业科学. 2014(05)
[9]恩诺沙星抗体与胶体金结合的最佳浓度和最佳pH的确定[J]. 孙素玲,张忠诚,许贝贝,邹艳彬.  动物医学进展. 2014(04)
[10]柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法[J]. 王伯阳,姜义仁,臧敏,石生林,杨瑞生,包臣,秦利.  蚕业科学. 2012(01)

博士论文
[1]纳米金比色法测定大分子分子量[D]. 凌凯.北京协和医学院 2013

硕士论文
[1]家蚕微粒子病免疫学快速检测试纸条的研制[D]. 芦琨.西南大学 2009



本文编号：3727319