黄瓜CsDREB1的克隆及霜霉威胁迫下的功能分析
发布时间：2023-01-05 18:48
黄瓜（Cucumis sativus L.）口感爽脆、用途广泛,是一类以温室栽培为主的蔬菜,生长状况易受环境及土壤影响,霜霉病为黄瓜主要的易感病害之一。霜霉威（Propamocarb）为一类内吸型杀菌剂,具有低毒性、半衰期短等特点,防治霜霉病效果良好。然而喷施霜霉威容易引起黄瓜体内霜霉威残留过高,引发新的食品安全问题。因此,黄瓜低农残的相关研究对提升黄瓜的品质和食用安全性意义重大。课题组前期通过对低农药残留品系‘D0351’进行转录组的测序,筛选得到了一个霜霉威胁迫下表达量明显下降的CsDREB1。推测CsDREB1为调控黄瓜农残的重要转录因子,通过调控其他基因发挥作用。本文通过克隆、表达模式分析、亚细胞定位等分子生物学。研究成果如下:（1）通过PCR技术成功克隆出CsDREB1的CDS序列,长度是603bp,编码200个氨基酸,包含一段63个氨基酸组成的AP2结构域,是AP2超级家族成员之一。（2）通过生物信息学方法预测该基因理论分子量22.26KD,属于不稳定亲水蛋白,无明显信号肽,无明显跨膜区域。黄瓜CsDREB1与甜瓜CmDREB1D之间的亲缘关系近,CsDREB1属于DREB...
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1.前言
1.1 研究目的及意义
1.2 研究内容及研究路线
1.2.1 主要研究内容
1.2.2 试验的技术路线图
1.3 国内外研究进展
1.3.1 蔬菜农药残留
1.3.2 霜霉威研究现状
1.4 AP2转录家族研究现状
1.4.1 AP2大家族的基本信息
1.4.2 DREB转录因子亚族
1.4.3 DREB抗逆性研究现状
2.材料与方法
2.1 试验种质材料
2.2 试验试剂及菌株
2.3 克隆CSDREB1
2.3.1 黄瓜果实RNA的提取和检测
2.3.2 合成cDNA的第一条链
2.3.3 CsDREB1的克隆
2.3.4 将CsDREB1的PCR扩增产物进行回收
2.3.5 与pEASY-T3载体的连接及阳性克隆筛选
2.4 CSDREB1的序列分析
2.5 CSDREB1的表达模式分析
2.6 CSDREB1亚细胞定位分析
2.6.1 构建植物绿色荧光表达载体
2.6.2 纯化质粒
2.6.3 制备拟南芥原生质体细胞
2.6.4 CsDREB1-pGII-EGFP质粒的拟南芥原生质体转化
2.7 CsDREB1对拟南芥的遗传转化
2.7.1 构建CsDREB1植物过量表达载体
2.7.2 重组质粒向根癌农杆菌的导入
2.8 获得CSDREB1转基因拟南芥植株
2.8.1 获得拟南芥转基因植株T0代种子
2.8.2 获得CsDREB1转基因拟南芥纯合株系
2.8.3 分子鉴定转基因拟南芥
2.8.4 转基因拟南芥霜霉威下功能分析
2.9 CSDREB1对黄瓜的遗传转化
2.9.1 试验材料与培养基
2.9.2 转基因实验的相关方法
2.9.3 侵染外植体
2.9.4 共培养并筛选培养外植体
2.9.5 分化芽的生根培养及转基因植株的驯化
2.9.6 确认转基因黄瓜植株并收集黄瓜种子
3.结果与分析
3.1 克隆CSDREB1
3.1.1 提取黄瓜总RNA
3.1.2 获得CsDREB1全长并酶切验证
3.2 CSDREB1的生物信息学分析
3.2.1 CsDREB1的序列分析
3.2.2 CsDREB1的系统进化树分析
3.2.3 分析CsDREB1的启动子区域顺式元件
3.3 CSDREB1的表达模式分析
3.3.1 CsDREB1在高农残品系‘D9320’和低农残品系‘D0351’中的表达分析
3.3.2 CsDREB1不同时间中的表达分析
3.3.3 CsDREB1不同器官中的表达分析
3.4 CSDREB1编码蛋白的亚细胞定位
3.4.1 CsDREB1-pGII-EGFP融合表达载体的鉴定
3.4.2 CsDREB1编码蛋白在拟南芥原生质体中的定位
3.5 CSDREB1转基因拟南芥植株的功能分析
3.5.1构建植物过量表达载体pBI121-CsDREB1
3.5.2 植物过量表达载体35S-CsDREB1的根癌农杆菌转化
3.5.3 T0代转基因拟南芥植株的筛选
3.5.4 PCR鉴定转基因CsDREB1拟南芥植株
3.5.5 过表达CsDREB1拟南芥的功能分析
3.6 其他逆境胁迫下CSDREB1的表达分析
3.7 黄瓜遗传转化
3.7.1 获得CsDREB1转基因黄瓜植株
3.7.2 鉴定抗性黄瓜植株
4.讨论
4.1 CSDREB1序列分析
4.2 CSDREB1的表达模式分析
4.3 CSDREB1的亚细胞定位分析
4.4 过表达CSDREB1拟南芥植株的抗性分析
4.5 其他胁迫下CSDREB1的表达分析
4.6 CSDREB1在黄瓜中的遗传转化
4.7 本研究的创新和不足之处
4.7.1 本研究的创新之处
4.7.2 本研究的不足之处
5.结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种酶制剂对稻米农残的影响[J]. 姜心禄,李旭毅,池忠志,吴茂力,陈莉,郑家国. 中国稻米. 2017(06)
[2]苦荞转录因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其对非生物胁迫的应答[J]. 刘为远,刘桂男,陈双,陈锴剑,黄云吉,邓仁榆,李成磊,吴琦. 基因组学与应用生物学. 2018(05)
[3]霜霉威在花椰菜上的消解动态及最终残留研究[J]. 于福利,王玉萍,雷琪,王旭. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2017(07)
[4]农药的环境影响和健康危害:科学证据和减量控害建议[J]. 金书秦,方菁. 环境保护. 2016(24)
[5]辣椒CaDREB3基因的克隆和表达特性分析[J]. 冯冬林,何水林,赖燕. 热带作物学报. 2016(12)
[6]菊花DmDREBa/b基因提高转基因烟草耐逆性研究[J]. 武剑,杨艳芳,王慧,朱凯,刘黎卿,陈发棣,喻德跃. 分子植物育种. 2016(11)
[7]霜霉威胁迫下黄瓜CsWRKY30表达及功能分析[J]. 李胜男,秦智伟,辛明,周秀艳. 中国农业科学. 2016(07)
[8]柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素处理下的表达[J]. 董翠翠,马岩岩,谢让金,邓烈,易时来,吕强,郑永强,何绍兰. 园艺学报. 2016(02)
[9]农药残留速测仪在蔬菜农残检测中的应用[J]. 古力先·依达也提. 现代食品. 2016(05)
[10]梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析[J]. 刘超,马丽,李月,代培红,姚正培,张桦. 基因组学与应用生物学. 2015(09)
博士论文
[1]黄瓜低霜霉威残留性相关基因CsDIR16的鉴定及功能分析[D]. 刘春红.东北农业大学 2017
[2]新疆野苹果MsDREB6.2转录因子在干旱应答中的作用机理研究[D]. 廖雄.中国农业大学 2016
[3]黄瓜CsABC19和CsPDR响应霜霉威胁迫的功能分析[D]. 孟晶晶.东北农业大学 2016
[4]吉林省玉米种植区耕层土壤中莠去津和乙草胺残留分布特征及风险评价[D]. 于晓斌.东北师范大学 2015
[5]黄瓜低霜霉威残留性的生理生化及分子基础研究[D]. 吴鹏.东北农业大学 2013
[6]转DREBIA基因和转BADH-CMO基因多年生黑麦草矮化机理与抗逆性研究[D]. 包永霞.北京林业大学 2012
[7]我国蔬菜主产地形成及其经济效应研究[D]. 吕超.南京农业大学 2011
[8]棉花GhDREB1调节低温抗性与生长发育的分子机理[D]. 黄金光.山东农业大学 2009
[9]GmDREB5互作蛋白GmTPR1的功能分析及利用核蛋白筛选系统克隆抗逆基因[D]. 曹新有.西北农林科技大学 2009
硕士论文
[1]黄花苜蓿MfDREB1转录因子在提高转基因烟草抗逆性中的作用研究[D]. 王欢.内蒙古大学 2016
[2]黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH的克隆及遗传转化[D]. 郭磊.东北农业大学 2016
[3]小麦抗逆相关转录因子基因DREB4A、W17转化株系筛选及其抗旱性鉴定[D]. 普正菲.西北农林科技大学 2016
[4]茉莉酸甲酯对水稻抗高温的效应[D]. 罗直文.江西农业大学 2015
[5]霜霉威在辣椒中的消解动态和残留规律及土壤中的光解研究[D]. 卢静宜.湖南农业大学 2015
[6]不同桑树杂交组合耐盐耐旱性及MnDREB4A功能研究[D]. 刘雪琴.西南大学 2015
[7]大豆DREB/CBF转录因子GmDREB1A的克隆及功能鉴定[D]. 李艳杰.吉林大学 2014
[8]霜霉威在烟田中的残留行为及效应研究[D]. 唐晶.湖南农业大学 2014
[9]玉米DREB1/CBF转录因子的克隆及其抗逆功能分析[D]. 周伟.吉林大学 2013
[10]将军菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遗传转化体系的建立[D]. 赵龙.南京农业大学 2013
本文编号：3727966
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
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摘要
英文摘要
1.前言
1.1 研究目的及意义
1.2 研究内容及研究路线
1.2.1 主要研究内容
1.2.2 试验的技术路线图
1.3 国内外研究进展
1.3.1 蔬菜农药残留
1.3.2 霜霉威研究现状
1.4 AP2转录家族研究现状
1.4.1 AP2大家族的基本信息
1.4.2 DREB转录因子亚族
1.4.3 DREB抗逆性研究现状
2.材料与方法
2.1 试验种质材料
2.2 试验试剂及菌株
2.3 克隆CSDREB1
2.3.1 黄瓜果实RNA的提取和检测
2.3.2 合成cDNA的第一条链
2.3.3 CsDREB1的克隆
2.3.4 将CsDREB1的PCR扩增产物进行回收
2.3.5 与pEASY-T3载体的连接及阳性克隆筛选
2.4 CSDREB1的序列分析
2.5 CSDREB1的表达模式分析
2.6 CSDREB1亚细胞定位分析
2.6.1 构建植物绿色荧光表达载体
2.6.2 纯化质粒
2.6.3 制备拟南芥原生质体细胞
2.6.4 CsDREB1-pGII-EGFP质粒的拟南芥原生质体转化
2.7 CsDREB1对拟南芥的遗传转化
2.7.1 构建CsDREB1植物过量表达载体
2.7.2 重组质粒向根癌农杆菌的导入
2.8 获得CSDREB1转基因拟南芥植株
2.8.1 获得拟南芥转基因植株T0代种子
2.8.2 获得CsDREB1转基因拟南芥纯合株系
2.8.3 分子鉴定转基因拟南芥
2.8.4 转基因拟南芥霜霉威下功能分析
2.9 CSDREB1对黄瓜的遗传转化
2.9.1 试验材料与培养基
2.9.2 转基因实验的相关方法
2.9.3 侵染外植体
2.9.4 共培养并筛选培养外植体
2.9.5 分化芽的生根培养及转基因植株的驯化
2.9.6 确认转基因黄瓜植株并收集黄瓜种子
3.结果与分析
3.1 克隆CSDREB1
3.1.1 提取黄瓜总RNA
3.1.2 获得CsDREB1全长并酶切验证
3.2 CSDREB1的生物信息学分析
3.2.1 CsDREB1的序列分析
3.2.2 CsDREB1的系统进化树分析
3.2.3 分析CsDREB1的启动子区域顺式元件
3.3 CSDREB1的表达模式分析
3.3.1 CsDREB1在高农残品系‘D9320’和低农残品系‘D0351’中的表达分析
3.3.2 CsDREB1不同时间中的表达分析
3.3.3 CsDREB1不同器官中的表达分析
3.4 CSDREB1编码蛋白的亚细胞定位
3.4.1 CsDREB1-pGII-EGFP融合表达载体的鉴定
3.4.2 CsDREB1编码蛋白在拟南芥原生质体中的定位
3.5 CSDREB1转基因拟南芥植株的功能分析
3.5.1构建植物过量表达载体pBI121-CsDREB1
3.5.2 植物过量表达载体35S-CsDREB1的根癌农杆菌转化
3.5.3 T0代转基因拟南芥植株的筛选
3.5.4 PCR鉴定转基因CsDREB1拟南芥植株
3.5.5 过表达CsDREB1拟南芥的功能分析
3.6 其他逆境胁迫下CSDREB1的表达分析
3.7 黄瓜遗传转化
3.7.1 获得CsDREB1转基因黄瓜植株
3.7.2 鉴定抗性黄瓜植株
4.讨论
4.1 CSDREB1序列分析
4.2 CSDREB1的表达模式分析
4.3 CSDREB1的亚细胞定位分析
4.4 过表达CSDREB1拟南芥植株的抗性分析
4.5 其他胁迫下CSDREB1的表达分析
4.6 CSDREB1在黄瓜中的遗传转化
4.7 本研究的创新和不足之处
4.7.1 本研究的创新之处
4.7.2 本研究的不足之处
5.结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种酶制剂对稻米农残的影响[J]. 姜心禄,李旭毅,池忠志,吴茂力,陈莉,郑家国. 中国稻米. 2017(06)
[2]苦荞转录因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其对非生物胁迫的应答[J]. 刘为远,刘桂男,陈双,陈锴剑,黄云吉,邓仁榆,李成磊,吴琦. 基因组学与应用生物学. 2018(05)
[3]霜霉威在花椰菜上的消解动态及最终残留研究[J]. 于福利,王玉萍,雷琪,王旭. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2017(07)
[4]农药的环境影响和健康危害:科学证据和减量控害建议[J]. 金书秦,方菁. 环境保护. 2016(24)
[5]辣椒CaDREB3基因的克隆和表达特性分析[J]. 冯冬林,何水林,赖燕. 热带作物学报. 2016(12)
[6]菊花DmDREBa/b基因提高转基因烟草耐逆性研究[J]. 武剑,杨艳芳,王慧,朱凯,刘黎卿,陈发棣,喻德跃. 分子植物育种. 2016(11)
[7]霜霉威胁迫下黄瓜CsWRKY30表达及功能分析[J]. 李胜男,秦智伟,辛明,周秀艳. 中国农业科学. 2016(07)
[8]柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素处理下的表达[J]. 董翠翠,马岩岩,谢让金,邓烈,易时来,吕强,郑永强,何绍兰. 园艺学报. 2016(02)
[9]农药残留速测仪在蔬菜农残检测中的应用[J]. 古力先·依达也提. 现代食品. 2016(05)
[10]梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析[J]. 刘超,马丽,李月,代培红,姚正培,张桦. 基因组学与应用生物学. 2015(09)
博士论文
[1]黄瓜低霜霉威残留性相关基因CsDIR16的鉴定及功能分析[D]. 刘春红.东北农业大学 2017
[2]新疆野苹果MsDREB6.2转录因子在干旱应答中的作用机理研究[D]. 廖雄.中国农业大学 2016
[3]黄瓜CsABC19和CsPDR响应霜霉威胁迫的功能分析[D]. 孟晶晶.东北农业大学 2016
[4]吉林省玉米种植区耕层土壤中莠去津和乙草胺残留分布特征及风险评价[D]. 于晓斌.东北师范大学 2015
[5]黄瓜低霜霉威残留性的生理生化及分子基础研究[D]. 吴鹏.东北农业大学 2013
[6]转DREBIA基因和转BADH-CMO基因多年生黑麦草矮化机理与抗逆性研究[D]. 包永霞.北京林业大学 2012
[7]我国蔬菜主产地形成及其经济效应研究[D]. 吕超.南京农业大学 2011
[8]棉花GhDREB1调节低温抗性与生长发育的分子机理[D]. 黄金光.山东农业大学 2009
[9]GmDREB5互作蛋白GmTPR1的功能分析及利用核蛋白筛选系统克隆抗逆基因[D]. 曹新有.西北农林科技大学 2009
硕士论文
[1]黄花苜蓿MfDREB1转录因子在提高转基因烟草抗逆性中的作用研究[D]. 王欢.内蒙古大学 2016
[2]黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH的克隆及遗传转化[D]. 郭磊.东北农业大学 2016
[3]小麦抗逆相关转录因子基因DREB4A、W17转化株系筛选及其抗旱性鉴定[D]. 普正菲.西北农林科技大学 2016
[4]茉莉酸甲酯对水稻抗高温的效应[D]. 罗直文.江西农业大学 2015
[5]霜霉威在辣椒中的消解动态和残留规律及土壤中的光解研究[D]. 卢静宜.湖南农业大学 2015
[6]不同桑树杂交组合耐盐耐旱性及MnDREB4A功能研究[D]. 刘雪琴.西南大学 2015
[7]大豆DREB/CBF转录因子GmDREB1A的克隆及功能鉴定[D]. 李艳杰.吉林大学 2014
[8]霜霉威在烟田中的残留行为及效应研究[D]. 唐晶.湖南农业大学 2014
[9]玉米DREB1/CBF转录因子的克隆及其抗逆功能分析[D]. 周伟.吉林大学 2013
[10]将军菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遗传转化体系的建立[D]. 赵龙.南京农业大学 2013
本文编号：3727966
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