啤酒花矮化类病毒不同变体致病性差异的分子机制研究

发布时间：2023-01-06 20:08

　　类病毒（viroid）是一类共价闭合环状的单链RNA,基因组大小在246-434 nt范围内,不能编码任何蛋白。到目前为止,类病毒只在高等植物（单子叶植物和双子叶植物）中被发现,其在植物上造成的症状与病毒危害的症状类似。虽然在类病毒-寄主互作方面,前人已经做了大量的研究,但是具体的互作机制尚不清晰。本研究以啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid,HSVd）/黄瓜（Cucumis sativus cv.’Suyo’）为研究系统,通过突变体接种、转录组测序以及miRNA测序等手段,研究了 HSVd-黄瓜之间的相互作用,进一步揭示了类病毒-寄主互作的机制。1.HSVd不同突变体致病性差异分析。来源于葡萄的HSVd变体HSVd-g接种啤酒花之后,经过15年的适应形成HSVd-h,HSVd-h和HSVd-g在25、26、54、193和281等5个位点存在碱基的差异,并且HSVd-h和HSVd-g在其指示寄主黄瓜上分别表现为弱毒和强毒。针对5个差异碱基,分别以HSVd-h和HSVd-g为模板,把HSVd-h中的碱基突变成HSVd-g中的碱基,反之亦然,构建突变体。HSVd-h系列5个突... 

【文章页数】：138 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 类病毒概述
        1.1.1 类病毒的发现
        1.1.2 类病毒的分类及二级结构
        1.1.3 类病毒的复制
        1.1.4 类病毒的重组与进化
        1.1.5 类病毒病害的防控
    1.2 类病毒的生物学特征
        1.2.1 类病毒的寄主范围
        1.2.2 类病毒引起的症状
        1.2.3 类病毒在寄主体内的运动
        1.2.4 类病毒的传播途径及地理分布
        1.2.5 交叉保护
    1.3 类病毒的致病机制
        1.3.1 类病毒特异结构单元调节其致病性
        1.3.2 类病毒与寄主因子相互作用
        1.3.3 RNA沉默
    1.4 寄主对类病毒的防御机制
        1.4.1 RNA沉默类病毒RNA
        1.4.2 核酸酶降解类病RNA
        1.4.3 寄主对类病毒RNA进行修饰
    1.5 啤酒花矮化类病毒
    1.6 高通量测序技术及RNA测序的种类
        1.6.1 高通量测序技术
        1.6.2 RNA测序的种类
    1.7 高通量测序在植物病毒学研究中的应用
        1.7.1 检测、发现和鉴定植物病毒和类病毒
        1.7.2 揭示植物-病毒或类病毒互作机制
    1.8 本研究的目的和意义
第二章 啤酒花矮化类病毒不同突变体致病性差异分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 HSVd突变体及其侵染性克隆的构建
        2.1.3 体外转录
        2.1.4 接种物的制备
        2.1.5 黄瓜幼苗的培养及接种
        2.1.6 总RNA的提取
        2.1.7 HSVd基因组的克隆和测序
        2.1.8 Northern blotting
    2.2 结果与分析
        2.2.1 HSVd突变体
        2.2.2 HSVd突变体的致病力
        2.2.3 HSVd-g系列突变体的复制效率
        2.2.4 HSVd-g系列突变体的遗传稳定性
    2.3 讨论
        2.3.1 类病毒碱基变化影响其致病力
        2.3.2 类病毒碱基突变影响其复制效率
        2.3.3 类病毒浓度积累与其致病力的关系
        2.3.4 类病毒突变体的稳定性
    2.4 结论
第三章 接种啤酒花矮化类病毒不同变体的黄瓜转录组分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 侵染性克隆的构建及体外转录
        3.1.3 接种物的制备、接种及植株的培养
        3.1.4 总RNA的提取
        3.1.5 HSVd基因组的克隆及测序
        3.1.6 Northern blotting
        3.1.7 cDNA文库的构建及RNA-seq
        3.1.8 差异表达基因的筛选
        3.1.9 差异表达基因的GO和KEGG富集分析
        3.1.10 荧光定量PCR
        3.1.11 光合速率的测定
    3.2 结果与分析
        3.2.1 HSVd-h和HSVd-g54在黄瓜上引起不同的症状
        3.2.2 接种HSVd-h和HSVd-g54的黄瓜的转录组测序结果
        3.2.3 接种HSVd-h和HSVd-g54的黄瓜基因表达情况的比较
        3.2.4 GO功能富集分析
        3.2.5 KEGG通路富集分析
        3.2.6 HSVd侵染诱导基本防御反应相关基因的表达
        3.2.7 HSVd侵染抑制光合作用相关基因的表达
        3.2.8 HSVd侵染诱导水杨酸相关基因的表达
        3.2.9 HSVd侵染诱导CsRDR1表达
    3.3 讨论
        3.3.1 类病毒侵染激发植物的基本防御反应
        3.3.2 类病毒侵染抑制植物光合作用
        3.3.3 水杨酸在类病毒-植物互作中的作用
        3.3.4 CsRDR1基因响应类病毒的侵染
    3.4 结论
第四章 啤酒花矮化类病毒不同变体对黄瓜miRNA的影响
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 侵染性克隆的构建及体外转录
        4.1.3 接种物的制备及接种
        4.1.4 总RNA的提取
        4.1.5 文库的构建及测序
        4.1.6 已知miRNA的比对
        4.1.7 新miRNA的预测
        4.1.8 差异表达miRNA的筛选
        4.1.9 miRNA及其靶标基因的荧光定量PCR
        4.1.10 miRNA靶基因的预测
        4.1.11 5'RLM-RACE
        4.1.12 miRNA靶标基因的GO和KEGG富集分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 高通量测序及黄瓜sRNA的特征
        4.2.2 已知miRNA的鉴定及表达
        4.2.3 新miRNA的鉴定及表达
        4.2.4 miRNA差异表达分析
        4.2.5 miRNA及其靶标基因的RT-qPCR验证
        4.2.6 差异表达miRNA靶标基因的预测
        4.2.7 5'RLM-RACE验证miRNA的剪切位点
        4.2.8 差异miRNA靶基因富集分析
    4.3 讨论
    4.4 结论
第五章 全文结论与展望
    5.1 全文结论
    5.2 研究展望
参考文献
致谢
附录
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]马铃薯纺锤块茎类病毒检测技术比较与选择[J]. 邱彩玲,吕文河,魏琪,吕典秋,李学湛,白艳菊.  中国马铃薯. 2013(06)
[2]苹果锈果类病毒北京分离物的检测与序列分析[J]. 吕文霞,张志想,姜冬梅,李世访,徐品三.  植物保护学报. 2013(05)
[3]高通量测序技术及其在农业科学研究中的应用[J]. 闫绍鹏,杨瑞华,冷淑娇,王秋玉,周容涛.  中国农学通报. 2012(30)
[4]高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J]. 岳桂东,高强,罗龙海,王军一,许姣卉,尹烨.  中国科学:生命科学. 2012(02)
[5]菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析[J]. 张志想,葛蓓孛,潘嵩,赵哲,王红清,李世访.  园艺学报. 2011(12)

博士论文
[1]啤酒花矮化类病毒寄主适应性和致病性研究[D]. 张志想.中国农业科学院 2012



本文编号：3728276