甜菜夜蛾肠道免疫防御粘质沙雷氏菌PS-1的iTRAQ分析

发布时间：2023-02-12 10:46

　　粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens Bizic)PS-1属于革兰氏阴性菌,是一类高效的昆虫致病菌。昆虫取食带病原物的食物,可通过肠道感染甜菜夜蛾等多种农业害虫。昆虫肠道免疫系统是防御PS-1侵染的第一道防线,但其免疫分子机制不清楚。为从蛋白水平上阐明甜菜夜蛾肠道免疫PS-1的分子机制,本研究利用iTRAQ技术测定PS-1侵染甜菜夜蛾5龄幼虫第3d的肠道蛋白质组,以本实验室深度测序的转录组为参考,筛选出甜菜夜蛾肠道免疫PS-1的差异蛋白211个,其中上调蛋白86个,下调蛋白125个。为从mRNA水平去检测差异蛋白的表达情况,我们从蛋白库中筛选出差异表达比较大的蛋白点,结合转录组获得的unigene片段。筛选了11个差异基因(JNK、Afadin、Hemolin、Unigene19139、Unigene50、Unigene25585、Unigene29765、Unigene4584、C L1044、Unigene14488、C L2840),qRT-PCR结果显示,甜菜夜蛾在饲喂PS-1第3d,JNK、Unigene19139、Unigene29765分别上调3、2、4倍...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
缩写词及英汉对照
1 前言
    1.1 昆虫的免疫系统概述
    1.2 昆虫的肠道免疫应答机制
    1.3 JNK和Afadin的研究进展
    1.4 iTRAQ的应用现状
    1.5 甜菜夜蛾的危害现状
    1.6 粘质沙雷氏菌在防治害虫和生产上的应用
    1.7 粘质沙雷氏菌的研究进展
    1.8 研究的目和意义
2 实验材料
    2.1 供试菌株
    2.2 供试昆虫
    2.3 主要仪器设备
    2.4 主要试剂药品
    2.5 主要培养基
    2.6 主要试剂的配制
    2.7 SDS-PAGE相关溶液的配制
    2.8 Western blot相关溶液的配制
3 实验方法
    3.1 粘质沙雷氏菌PS-1处理甜菜夜蛾
    3.2 iTRAQ测序流程
        3.2.1 iTRAQ质谱原始数据处理
        3.2.2 基因功能注释
        3.2.3 KEGG通路注释
        3.2.4 差异表达蛋白的筛选
        3.2.5 聚类分析
    3.3 差异表达蛋白所对应基因的qRT-PCR验证
        3.3.1 PS-1菌液的配制
        3.3.2 处理与收集样品
        3.3.3 实时荧光定量PCR
    3.4 甜菜夜蛾JNK和Afadin基因的克隆与序列分析
        3.4.1 甜菜夜蛾总RNA的提取和检测
        3.4.2 甜菜夜蛾JNK和Afadin基因CDS序列的扩增
    3.5 Western blot检测
        3.5.1 样品制备
        3.5.2 浓度测定
        3.5.3 Western blot
4 结果与分析
    4.1 iTRAQ测序结果
        4.1.1 定量结果评估
        4.1.2 差异基因分析
        4.1.3 GO功能注释
        4.1.4 GO功能显著性富集分析
        4.1.5 KEGG富集分析
        4.1.6 差异蛋白的聚类分析
    4.2 差异表达蛋白对应基因的qRT-PCR验证
    4.3 JNK和Afadin基因的克隆和序列分析
        4.3.1 甜菜夜蛾总RNA的提取
        4.3.2 JNK Unigene序列的克隆
        4.3.3 Afadin Unigene序列的克隆
        4.3.4 JNK和Afadin Unigene序列分析
        4.3.5 JNK在不同发育阶段的表达分析
    4.4 Western blot
5 结论与讨论
    5.1 结论
    5.2 讨论
    5.3 展望
    5.4 本研究的创新点
致谢
特别感谢本论文赞助基金
参考文献
附录Ⅰ pMD18-T Vector map
附录Ⅱ 引物



本文编号：3740961