柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选及F9菌株抑菌物质的探究

发布时间：2023-02-18 15:45

　　柑橘溃疡病由黄单胞杆菌属地毯草黄单胞柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的一种细菌性病害。柑橘溃疡病菌能侵染植株的叶片、枝条、皮刺和果实,引起叶片及果实溃疡斑,降低果实的品质和营养价值,严重时会导致落叶落果,树势减弱,已经被列为世界范围内的检疫性病害。目前,普遍采用铜制剂及农用抗生素进行防治。然而,传统化学农药施用易引起了环境污染、农药残留及病原菌耐药性等一系列问题,使得近年来发展安全、无毒、无污染的新型生物农药倍受重视。本文旨在筛选拮抗柑橘溃疡病菌的土壤细菌,并针对鉴定到的一株F9拮抗菌株,进行其抑菌物质的初步探索。1.本文从湖南省永州市江永县患病的柑橘果园根际土壤中取样,分离根际微生物。采用抑菌圈法筛选拮抗柑橘溃疡病菌的细菌,总共筛选到22株具有抑菌活性的细菌。采用细菌16SrDNA基因序列比对的方法,初步鉴定其中2株属于假单胞属,1株属于节杆菌属,19株属于芽孢杆菌属。对其中抑菌效果明显的菌株上清液进行抑菌活性实验,其中编号F4,F6,F9的三株细菌上清液具有抑菌活性。2.文中选取了抑菌活性最强的F9菌株进行了深入研究。采用扫...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩写词和英汉对照表
第一章 前言
    1.1 柑橘溃疡病及柑橘溃疡病菌简介
    1.2 柑橘溃疡病菌的生理形态特征
    1.3 柑橘溃疡病菌的侵染循环
    1.4 柑橘溃疡病的防治
        1.4.1 物理防治
        1.4.2 化学防治
        1.4.3 生物防治
    1.5 芽孢杆类拮抗菌的研究现状
        1.5.1 芽孢杆菌的生防机制
        1.5.2 生防芽孢的种类
    1.6 解淀粉芽孢杆菌抑菌物质
        1.6.1 抗菌蛋白
        1.6.2 脂肽类物质
        1.6.3 聚酮类物质
    1.7 研究目的和意义
    1.8 技术路线图
第二章 柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选鉴定
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 供试材料
            2.2.1.1 菌株
            2.2.1.2 主要仪器
        2.2.2 柑橘溃疡病拮抗细菌的筛选
            2.2.2.1 柑橘根际土壤样品采集
            2.2.2.2 柑橘溃疡病菌拮抗菌的分离筛选
            2.2.2.3 拮抗细菌的复筛
            2.2.2.4 拮抗菌发酵上清液活性测试
        2.2.3 拮抗菌的种类鉴定
            2.2.3.1 拮抗细菌 16SrDNA序列PCR测定与分析
            2.2.3.2 芽孢杆菌 16-23S之间ITS序列扩增
            2.2.3.3 拮抗芽孢杆菌种间的系统发育树构建
    2.3 结果与分析
        2.3.1 拮抗菌筛选
            2.3.1.1 拮抗菌初筛
            2.3.1.2 拮抗菌的复筛
        2.3.2 拮抗菌株鉴定
        2.3.3 ITS基因序列扩增鉴定
        2.3.4 拮抗菌发酵上清液活性测试
    2.4 讨论
第三章 拮抗菌株F9的鉴定及其抑菌物质的探究
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 供试材料
            3.2.1.1 供试菌株
            3.2.1.2 培养基及配方
            3.2.1.3 主要仪器
        3.2.2 拮抗菌株F9的鉴定
            3.2.2.1 拮抗菌株F9的菌落形态
            3.2.2.2 拮抗菌株F9生理生化特性检测
            3.2.2.3 拮抗菌株F9的 16SrDNA PCR鉴定
            3.2.2.4 拮抗菌株F9的ITS PCR鉴定
            2.2.3.5 解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶基因序列特异性扩增
        3.2.3 拮抗芽孢杆菌F9抑菌效果测试
            3.2.3.1 F9菌体抑菌效果测试
            3.2.3.2 F9发酵上清液的抑菌效果测试
            3.2.3.3 F9产抑菌物质培养基的选择
        3.2.4 F9抑菌物质的探究
            3.2.4.1 抑菌蛋白的提取
            3.2.4.2 抑菌蛋白稳定性的研究
            3.2.4.3 脂肽的提取
            3.2.4.4 脂肽稳定性的研究
        3.2.5 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响
            3.2.5.1 脂肽粗提的浓度检测
            3.2.5.2 Xac jx-6 生长曲线的测量
        3.2.6 拮抗菌F9菌体盆栽接种防治试验
            3.2.6.1 微生物的培养
            3.2.6.2 柑橘盆栽接种试验
        3.2.7 粗提脂肽活体接种防治效果
            3.2.7.1 微生物的培养
            3.2.7.2 柑橘盆栽接种试验
        3.2.8 粗提脂肽的抑菌谱试验
        3.2.9 粗提脂肽的分离纯化
        3.2.10 抑菌物质LC-MS分析
        3.2.11 初纯抑菌物质的最小抑菌浓度(MIC)测定
    3.3 结果和分析
        3.3.1 F9菌落形态
        3.3.2 F9生理生化鉴定
        3.3.3 F9 β-甘露聚糖酶基因序列特异性扩增
        3.3.4 F9系统发育树
        3.3.5 F9透射电镜图
        3.3.6 拮抗菌株F9抑菌测试
            3.3.6.1 F9菌体的抑菌效果
            3.3.6.2 F9发酵上清液抑菌效果
        3.3.7 培养基的筛选
        3.3.8 F9菌株上清液抑菌物质的提取和验证
            3.3.8.1 抑菌蛋白的提取
            3.3.8.2 抑菌蛋白稳定性
        3.3.9 F9上清液脂肽的提取和验证
            3.3.9.1 粗提脂肽的抑菌活性
            3.3.9.2 粗提脂肽稳定性试验
        3.3.10 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响
            3.3.10.1 粗提脂肽的浓度测量
            3.3.10.2 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响
        3.3.11 F9菌体盆栽防治试验
        3.3.12 粗提脂肽盆栽防治试验
        3.3.13 粗提脂肽的抑菌谱
        3.3.14 初步纯化后抑菌物质的最小抑菌浓度(MIC)的测定
        3.3.15 粗提脂肽的分离纯化
            3.3.15.1 抑菌活性组分的初步分离
            3.3.15.2 初步纯化后活性物质的HPLC分析
            3.3.15.3 Sephadex G-25 凝胶柱过滤纯化
            3.3.15.4 抑菌物质LC-MS分析
    3.4 讨论
        3.4.1 抑菌物质的提取
        3.4.2 抑菌物质的盆栽接种防治试验
        3.4.3 抑菌物质的分离纯化
        3.4.4 抑菌物质的鉴定
致谢
参考文献
附录



本文编号：3745251