柑橘黄龙病菌分泌蛋白Clsp33致病机理初步研究

发布时间：2023-03-05 05:53

　　柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种由革兰氏阴性细菌韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)引起的重要检疫病害。该病病原分为三个亚种:“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas,亚洲种)、“Ca.L.africanus”(CLaf,非洲种)和“Ca.L.americanus”(CLam,美洲种)。其中,CLas和CLam由亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,而CLaf则是由非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)传播。目前对该病害的防控还没有有效的药剂,商业化柑橘品种对该病均没有抗性,当前防控主要通过控制木虱传播、及时砍除病树和使用无病苗木。黄龙病菌尚不能离体培养,难以进行传统的分子和遗传操作,因此极大制约了对黄龙病菌毒力机制的认知。随着生物信息学的发展,2009年公布了首个CLas株系的全基因组序列,为后续研究奠定了基础。效应蛋白是由病原菌编码产生的一类重要蛋白,根据其在寄主细胞的定位可分为胞外效应蛋白(Apoplastic effectors)和胞内效应蛋白(...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 文献综述
    1.1 柑橘黄龙病概述
        1.1.1 病原的发现与分类
        1.1.2 病原的分子特性
        1.1.3 寄主感病症状
        1.1.4 病原的传播方式及宿主范围
        1.1.5 防控技术
    1.2 黄龙病菌分泌系统和假定效应子研究进展
        1.2.1 分泌系统
        1.2.2 效应蛋白
第2章 引言
第3章 柑橘黄龙病菌效应蛋白Clsp33 生物信息学与分泌特性研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试毒源和苗木
        3.1.2 菌株和载体
        3.1.3 主要试剂(盒)
        3.1.4 主要存储液配制
        3.1.5 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 生物信息学分析
        3.2.2 引物设计
        3.2.3 T载体构建
        3.2.4 构建原核表达载体
        3.2.5 转化BL21 进行原核表达
        3.2.6 总RNA提取
        3.2.7 cDNA合成和qPCR分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 生物信息学分析
        3.3.2 编码基因Clsp33和phoA的 T载体构建
        3.3.3 原核表达载体构建
        3.3.4 BL21 原核表达验证
        3.3.5 Clsp33 在宿主甜橙和木虱中差异表达
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 效应蛋白Clsp33 亚细胞定位及生物学功能分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试苗木
        4.1.2 菌株和载体
        4.1.3 主要试剂(盒)
        4.1.4 主要存储液配制
        4.1.5 主要仪器和材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 锌指结构预测
        4.2.2 核定位信号预测
        4.2.3 引物设计
        4.2.4 植物表达载体构建
        4.2.5 农杆菌感受态制备
        4.2.6 农杆菌转化
        4.2.7 农杆菌注射
        4.2.8 亚细胞定位
        4.2.9 Northern blot
    4.3 结果与分析
        4.3.1 核定位信号突变对Clsp33 亚细胞定位的影响
        4.3.2 核定位信号突变对Clsp33 致病性的影响
        4.3.3 高温能影响Clsp33 的亚细胞定位
        4.3.4 Clsp33 致病性与其进核数量相关
        4.3.5 锌指结构突变不影响Clsp33 致病性
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 效应蛋白Clsp33 在甜橙寄主中互作蛋白的筛选
    5.1 实验材料
        5.1.1 供试苗木
        5.1.2 菌株和载体
        5.1.3 主要试剂
        5.1.4 主要储存液配置
        5.1.5 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 引物设计
        5.2.2 载体构建
        5.2.3 酵母AH109 感受态的制备
        5.2.4 转化
        5.2.5 利用β-半乳糖苷酶鉴定酵母互作
        5.2.6 BiFC验证蛋白互作
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Clsp33 与拟南芥PINP1 在酵母中互作
        5.3.2 Clsp33 与甜橙CsPINP1 在酵母中有弱互作
        5.3.3 Clsp33 与甜橙CsPINP1 在植物中有互作
    5.4 讨论
    5.5 小结
第6章 主要结论、创新点与展望
    6.1 主要结论
        6.1.1 Clsp33 的生物信息学分析和分泌特性验证
        6.1.2 Clsp33 的亚细胞定位和生物学功能分析
        6.1.3 Clsp33 在甜橙寄主中互作蛋白的筛选
    6.2 创新点
    6.3 展望
参考文献
附录 缩略词与中英文对照表
在读期间发表论文及参加科研项目情况
致谢



本文编号：3755835