亚细胞定位维持甘蔗线条花叶病毒P1蛋白抑制子活性和致病性的作用机制

发布时间：2023-04-02 21:58

　　甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)禾草病毒属(Poacevirus),是引起甘蔗花叶病的三种主要病原之一。SCSMV的P1蛋白能抑制单链RNA诱导的局部沉默,但尚不了解其能否抑制系统沉默和双链RNA引起的局部沉默,以及其是否具有致病决定因子的功能。植物病毒编码的抑制子蛋白的亚细胞定位,能够显著影响其RNA沉默抑制的活性,继而调控病毒的致病性。本研究首先利用农杆菌浸润本氏烟的瞬时表达实验来确定P1蛋白的沉默抑制活性。将P1与ssGFP及含发夹结构的dsFP在本氏烟上混合注射,番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)的抑制子P19作为阳性对照,空载体作为阴性对照。3天后在紫外灯下观察注射叶片,发现P1注射区域与P19一样有很强的绿色荧光,阴性对照基本无荧光,说明P1能抑制单链或双链RNA诱导的局部沉默。Western blot检测结果与观察结果一致,P19与P1区域的GFP蛋白量明显多于空载体。在16c转基因本氏烟上混合注射P1和ssGFP来确定P1的系统沉...

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
文献综述
    1 甘蔗线条花叶病毒
        1.1 分类地位
        1.2 寄主范围及症状
        1.3 传播途径
        1.4 SCSMV的基因组结构
    2 RNA沉默
        2.1 RNA沉默的发现
        2.2 RNA沉默的基本过程
        2.3 RNA沉默通路中的关键因子
    3.RNA沉默抑制子研究进展
        3.1 结合长dsRNA抑制DCL切割
        3.2 结合双链siRNA抑制RISC复合体的形成
        3.3 作用于RNA沉默通路的关键蛋白
    4.亚细胞定位对VSRs抑制能力及致病性的影响
        4.1 VSRs作为致病决定因子
        4.2 亚细胞定位对VSRs抑制活性的影响
        4.3 亚细胞定位对VSRs致病性的影响
    5 研究目的与意义
材料与方法
    1 材料
        1.1 植物材料与菌株
        1.2 主要质粒载体
        1.3 酶和化学试剂
    2 试剂、溶液和培养基的配制
        2.1 常用试剂、溶液和培养基
        2.2 Western blot相关试剂
        2.3 农杆菌介导的瞬时表达系统相关试剂
    3 实验方法
        3.1 植物总RNA的提取
        3.2 反转录
        3.3 PCR(聚合酶链式反应)
        3.4 PCR产物的纯化
        3.5 DNA片段与载体的连接
        3.6 Gateway反应体系
        3.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备与转化
        3.8 质粒提取
        3.9 农杆菌感受态的制备与转化
        3.10 农杆菌浸润法介导的瞬时表达
        3.11 长波紫外灯下观察与拍摄及激光共聚焦显微镜观察
        3.12 Western blot检测
        3.13 DAB染色
        3.14 台盼蓝染色
结果与分析
    1 P1蛋白的沉默抑制功能分析
        1.1 表达载体的构建
        1.2 P1蛋白的局部沉默抑制功能研究
        1.3 P1蛋白的系统沉默抑制功能研究
    2 P1蛋白对病毒致病性的影响
    3 P1蛋白的亚细胞定位
    4 P1蛋白核定位信号突变对其沉默抑制功能的影响
    5 P1蛋白核定位信号突变对病毒致病性的影响
讨论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的论文
致谢



本文编号：3780039