中华蜜蜂触角特异化学通讯蛋白CSP1及ASP2与化学配基相互作用的分子机制研究
发布时间：2023-04-03 21:35
在复杂的自然环境中,昆虫通过其敏锐的化学通讯系统来识别所处环境中的各种化学信息物质,并作出反应。在昆虫化学感受系统中,往往存在着两类酸性、低分子量的蛋白,即化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)和气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)。中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(简称中蜂)善于采集零星蜜源,具有灵敏发达的化学感受系统。触角是蜜蜂重要的化学通讯器官,因此研究中蜂触角特异表达蛋白的生理功能,对于深入了解中蜂化学通讯识别机理具有重要的理论意义。此外,蜜蜂因受到新烟碱类杀虫剂的高致毒性而引起广泛关注。新烟碱杀虫剂已被证实即使在亚致死剂量下仍能对蜜蜂嗅觉、化学感受和学习等行为产生严重的影响。因此,本研究在前期发现的几个高丰度表达于工蜂触角的CSPs和OBPs基因和配基结合功能基础上,通过多重荧光光谱实验及热动力学分析它们与相应天然配基以及新烟碱类杀虫剂吡虫啉的结合特性,并用分子对接和定点突变技术鉴定了CSP1分别与β-紫罗兰酮和吡虫啉结合过程中的关键氨基酸残基,并证实了在亚致死剂量下的吡虫啉仍...
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
1 绪论
1.1 蜜蜂概述
1.1.1 蜜蜂生物学特性
1.1.2 蜜蜂间的通讯
1.2 昆虫间嗅觉识别及相关蛋白概述
1.2.1 气味结合蛋白与化学感受蛋白简介
1.2.2 气味结合蛋白与化学感受蛋白的研究进展
1.3 生化结合及定点突变研究进展
1.3.1 生化结合、分子互作研究进展
1.3.2 定点突变研究进展
1.4 研究背景、内容和意义
1.4.1 研究背景
1.4.2 研究内容
1.4.3 研究意义
2 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表达、蛋白纯化及配基结合机理研究
2.1 材料与方法
2.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
2.1.2 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4表达载体的构建
2.1.3 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的诱导表达
2.1.4 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的分离纯化与复性
2.1.5 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的结合机理分析
2.2 结果与分析
2.2.1 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4蛋白诱导、纯化
2.2.2 荧光猝灭光谱分析
2.2.3 猝灭机理及结合常数分析
2.2.4 热力学分析
2.2.5 CSP1的紫外吸收光谱测定
2.2.6 CSP1的同步荧光分析
2.2.7 CSP1的圆二色 (CD)光谱分析
2.2.8 分子对接
2.2.9 吡虫啉影响CSP1的功能分析
2.3 讨论
3 中蜂CSP1与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点鉴定
3.1 材料与方法
3.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
3.1.2 分子对接
3.1.3 设计突变引物和定点突变
3.1.4 突变蛋白诱导及荧光结合实验
3.2 结果与分析
3.2.1 分子对接
3.2.2 引物设计及突变结果
3.2.3 突变蛋白诱导及荧光猝灭实验
3.2.4 CSP1突变蛋白与β-紫罗兰酮的热力学分析及分子对接
3.2.5 CSP1突变蛋白与吡虫啉的荧光猝灭实验及热力学分析
3.3 讨论
4 中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的基因克隆及基因可变性分析
4.1 材料与方法
4.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
4.1.2 中华蜜蜂触角总RNA提取和反转录
4.1.3 中蜂ASP2的基因扩增、克隆及测序
4.1.4 中蜂ASP2的基因序列及蛋白结构分析
4.2 结果与分析
4.2.1 中华蜜蜂触角总RNA提取、反转录及基因扩增克隆
4.2.2 中华蜜蜂ASP2基因序列分析
4.2.3 中蜂ASP2与意蜂ASP2比对及基因剪切情况
4.2.4 中意蜂ASP2的分子对接
4.3 讨论
5 中蜂ASP2与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
5.1.2 定点突变
5.1.3 突变蛋白诱导及荧光结合实验
5.2 结果与分析
5.2.1 定点突变及突变蛋白诱导
5.2.2 野生型ASP2蛋白及突变型ASP2蛋白与β-紫罗兰酮的荧光结合实验及热力学分析
5.2.3 野生型ASP2蛋白及突变型ASP2蛋白与吡虫啉的荧光结合实验及热力学分析
5.3 讨论
6 中华蜜蜂触角的扫描电镜与化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.1 材料与方法
6.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
6.1.2 中华蜜蜂触角的扫描电镜
6.1.3 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1抗体的制备及效价测定
6.1.4 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.2 结果与分析
6.2.1 中华蜜蜂触角的扫描电镜
6.2.2 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1抗体的制备及效价测定
6.2.3 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.3 讨论
7 总结与展望
7.1 研究总结
7.1.1 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表达、蛋白纯化及配基结合机理研究
7.1.2 定点突变确定中蜂CSP1与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点
7.1.3 中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的基因克隆及基因编辑分析
7.1.4 定点突变确定中蜂ASP2与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点
7.1.5 中华蜜蜂触角的扫描电镜与化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
7.2 课题展望
参考文献
作者简介
本文编号：3781186
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
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致谢
摘要
abstract
1 绪论
1.1 蜜蜂概述
1.1.1 蜜蜂生物学特性
1.1.2 蜜蜂间的通讯
1.2 昆虫间嗅觉识别及相关蛋白概述
1.2.1 气味结合蛋白与化学感受蛋白简介
1.2.2 气味结合蛋白与化学感受蛋白的研究进展
1.3 生化结合及定点突变研究进展
1.3.1 生化结合、分子互作研究进展
1.3.2 定点突变研究进展
1.4 研究背景、内容和意义
1.4.1 研究背景
1.4.2 研究内容
1.4.3 研究意义
2 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表达、蛋白纯化及配基结合机理研究
2.1 材料与方法
2.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
2.1.2 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4表达载体的构建
2.1.3 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的诱导表达
2.1.4 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的分离纯化与复性
2.1.5 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重组蛋白的结合机理分析
2.2 结果与分析
2.2.1 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4蛋白诱导、纯化
2.2.2 荧光猝灭光谱分析
2.2.3 猝灭机理及结合常数分析
2.2.4 热力学分析
2.2.5 CSP1的紫外吸收光谱测定
2.2.6 CSP1的同步荧光分析
2.2.7 CSP1的圆二色 (CD)光谱分析
2.2.8 分子对接
2.2.9 吡虫啉影响CSP1的功能分析
2.3 讨论
3 中蜂CSP1与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点鉴定
3.1 材料与方法
3.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
3.1.2 分子对接
3.1.3 设计突变引物和定点突变
3.1.4 突变蛋白诱导及荧光结合实验
3.2 结果与分析
3.2.1 分子对接
3.2.2 引物设计及突变结果
3.2.3 突变蛋白诱导及荧光猝灭实验
3.2.4 CSP1突变蛋白与β-紫罗兰酮的热力学分析及分子对接
3.2.5 CSP1突变蛋白与吡虫啉的荧光猝灭实验及热力学分析
3.3 讨论
4 中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的基因克隆及基因可变性分析
4.1 材料与方法
4.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
4.1.2 中华蜜蜂触角总RNA提取和反转录
4.1.3 中蜂ASP2的基因扩增、克隆及测序
4.1.4 中蜂ASP2的基因序列及蛋白结构分析
4.2 结果与分析
4.2.1 中华蜜蜂触角总RNA提取、反转录及基因扩增克隆
4.2.2 中华蜜蜂ASP2基因序列分析
4.2.3 中蜂ASP2与意蜂ASP2比对及基因剪切情况
4.2.4 中意蜂ASP2的分子对接
4.3 讨论
5 中蜂ASP2与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
5.1.2 定点突变
5.1.3 突变蛋白诱导及荧光结合实验
5.2 结果与分析
5.2.1 定点突变及突变蛋白诱导
5.2.2 野生型ASP2蛋白及突变型ASP2蛋白与β-紫罗兰酮的荧光结合实验及热力学分析
5.2.3 野生型ASP2蛋白及突变型ASP2蛋白与吡虫啉的荧光结合实验及热力学分析
5.3 讨论
6 中华蜜蜂触角的扫描电镜与化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.1 材料与方法
6.1.1 主要实验材料、试剂与仪器
6.1.2 中华蜜蜂触角的扫描电镜
6.1.3 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1抗体的制备及效价测定
6.1.4 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.2 结果与分析
6.2.1 中华蜜蜂触角的扫描电镜
6.2.2 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1抗体的制备及效价测定
6.2.3 中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
6.3 讨论
7 总结与展望
7.1 研究总结
7.1.1 中华蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表达、蛋白纯化及配基结合机理研究
7.1.2 定点突变确定中蜂CSP1与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点
7.1.3 中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的基因克隆及基因编辑分析
7.1.4 定点突变确定中蜂ASP2与β-紫罗兰酮、吡虫啉作用中关键氨基酸位点
7.1.5 中华蜜蜂触角的扫描电镜与化学感受蛋白CSP1的亚细胞定位
7.2 课题展望
参考文献
作者简介
本文编号：3781186
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3781186.html
