利用RNAi技术培育抗二化螟转基因水稻和全长cDNA PET文库的开发
发布时间：2023-04-06 20:16
水稻是重要的粮食作物之一,世界一半以上的人口都以它为主粮。稳定的水稻产量维系着国家粮食安全与社会安定。但是水稻几乎在其生长发育的各个时期都会受到相应害虫的侵害,而二化螟则是其中影响最为严重的害虫之一。近几十年来,BT转基因抗虫技术的应用有效地控制了部分主要害虫对作物的侵害,减少了经济损失,同时减轻了农药对生态环境的破坏。然而我们也应该注意到,由于BT杀虫蛋白的选择压力,在实验室已然出现了 BT抗性个体。尽管科研工作者们已被动地采取了一些措施来控制这些抗性个体的发展,但是我们更应该采取更加积极主动的态度,开发有效控制害虫的新策略。RNAi技术在近二十年来,从发现到认识再到应用,逐渐成为害虫防治领域最有希望能够比肩BT转基因抗虫技术的潜力策略。本研究基于以上初衷,尝试将该策略应用到水稻的害虫防治上。主要结果如下:1.测序并收录水稻8种重要害虫的转录组数据,整理并构建水稻害虫转录组数据库(http://rptdb.hzau.edu.cn),旨在为世界范围内的昆虫功能基因组、昆虫治理等学科科研工作者提供相关数据,以弥补这些遗传信息的缺乏。统计90日内数据库的日均独立访客数为25次。2.选取22...
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 研究问题的由来
2 RNAi技术概述
2.1 RNAi的发现
2.2 小RNA的分类及其机制
2.2.1 Dicer蛋白与AGO(Argonaut)蛋白
2.2.2 siRNA
2.2.3 miRNA
2.2.4 piRNA
3 RNAi在植物保护领域的应用
3.1 害虫防治的现实问题
3.2 RNAi技术应用于害虫防治
3.2.1 dsRNA的合成
3.2.2 dsRNA进入昆虫的方式
3.2.3 昆虫体内RNAi反应的分类
3.2.4 昆虫吸收dsRNA的机制
3.2.4.1 跨膜通道介导的dsRNA吸收机制
3.2.4.2 细胞内吞介导的dsRNA吸收途径
3.2.4.3 免疫相关途径
3.2.5 与系统性RNAi关系密切的蛋白
3.2.6 dsRNA靶基因的选择
3.2.7 miRNA介导的害虫防治
3.3 RNAi抗虫面临的问题和挑战
3.3.1 dsRNA剂量不足
3.3.2 dsRNase对取食摄入dsRNA的快速降解
3.3.3 脱靶效应和边缘效应
4 分离转录起始位点及终止位点的方法
5 本研究的目的与意义
第二章 水稻主要害虫转录组分析及数据库建设
1 试验材料
1.1 8种水稻重要害虫转录组的获得
2 试验方法
2.1 Unigene的注释
2.2 直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)预测
2.3 进化关系分析
2.4 数据库的实现
3 结果与分析
3.1 各个转录组的基本信息
3.2 进化分析结果
3.2.1 物种进化树
3.3 数据库界面及操作
3.3.1 数据浏览
3.3.2 数据检索
4 讨论
4.1 昆虫转录组的差异
4.2 物种分化时间
第三章 利用RNAi技术培育抗二化螟水稻
1 试验材料
1.1 水稻品种
1.2 载体与菌株
1.3 二化螟幼虫
1.4 miRNA抗虫转基因水稻csu-15
2 试验方法
2.1 二化螟总RNA的抽提及反转录
2.2 候选靶标片段的选择
2.3 干涉载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
2.4 转化植株的T0代阳性检测
2.5 利用Southern blotting对转化植株进行拷贝数检测
2.5.1 植物基因组大量样品抽提
2.5.2 基因组DNA的检测
2.5.3 酶切和虹吸法转膜印记
2.5.4 预杂交
2.5.5 标探针、加探针
2.5.6 洗膜及压磷屏显像
2.6 转化植株的表达量检测
2.7 体外dsRNA的人工合成
2.8 喂虫试验
2.8.1 人工饲料饲喂
2.8.2 室内幼苗饲喂
2.8.3 室内茎秆接虫
2.8.3.1 短期茎秆抗虫鉴定
2.8.3.2 二化螟全生育期连续喂食
2.9 喂食csu-15材料的二化螟中肠组织差异表达分析
2.9.1 二化螟中肠组织RNA分离及测序
2.9.2 差异表达分析
2.9.3 miRNA靶标预测
3 结果与分析
3.1 dsRNA的合成
3.2 dsRNA人工饲料饲喂试验结果
3.3 转化片段植株拷贝数检测及表达量检测
3.3.1 植株拷贝数检测
3.3.2 植株表达量检测
3.4 室内茎秆饲喂结果
3.5 csu-15二化螟抗性鉴定及喂食后二化螟中肠差异表达分析
3.5.1 csu-15转基因植株对二化螟的抗性鉴定
3.5.2 二化螟中肠差异表达分析
4 讨论
4.1 RNAi抗虫策略遇到的问题与解决思路
4.2 dsRNA抗虫与miRNA抗虫的比较
第四章 水稻全长cDNA PET文库构建及分析
1 试验材料
2 试验方法
2.1 RNA抽提
2.2 全长cDNA的获得与文库制备
2.3 测序
2.4 数据分析及评估
3 结果与分析
3.1 测序与TSS-PAS对提取结果
3.2 两个水稻数据库匹配结果
3.2.1 RAGP 7比对结果
3.2.2 KOME比对结果
3.2.3 可变的转录起始位点或转录终止位点
4 讨论
4.1 全长cDNA PET文库构建
4.2 利用RAPG 7与KOME数据库对本策略的评估
4.3 与三代测序全长转录组的比较
参考文献
附录1 全长cDNA文库构建过程中涉及的自定义序列
致谢
本文编号：3784347
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 研究问题的由来
2 RNAi技术概述
2.1 RNAi的发现
2.2 小RNA的分类及其机制
2.2.1 Dicer蛋白与AGO(Argonaut)蛋白
2.2.2 siRNA
2.2.3 miRNA
2.2.4 piRNA
3 RNAi在植物保护领域的应用
3.1 害虫防治的现实问题
3.2 RNAi技术应用于害虫防治
3.2.1 dsRNA的合成
3.2.2 dsRNA进入昆虫的方式
3.2.3 昆虫体内RNAi反应的分类
3.2.4 昆虫吸收dsRNA的机制
3.2.4.1 跨膜通道介导的dsRNA吸收机制
3.2.4.2 细胞内吞介导的dsRNA吸收途径
3.2.4.3 免疫相关途径
3.2.5 与系统性RNAi关系密切的蛋白
3.2.6 dsRNA靶基因的选择
3.2.7 miRNA介导的害虫防治
3.3 RNAi抗虫面临的问题和挑战
3.3.1 dsRNA剂量不足
3.3.2 dsRNase对取食摄入dsRNA的快速降解
3.3.3 脱靶效应和边缘效应
4 分离转录起始位点及终止位点的方法
5 本研究的目的与意义
第二章 水稻主要害虫转录组分析及数据库建设
1 试验材料
1.1 8种水稻重要害虫转录组的获得
2 试验方法
2.1 Unigene的注释
2.2 直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)预测
2.3 进化关系分析
2.4 数据库的实现
3 结果与分析
3.1 各个转录组的基本信息
3.2 进化分析结果
3.2.1 物种进化树
3.3 数据库界面及操作
3.3.1 数据浏览
3.3.2 数据检索
4 讨论
4.1 昆虫转录组的差异
4.2 物种分化时间
第三章 利用RNAi技术培育抗二化螟水稻
1 试验材料
1.1 水稻品种
1.2 载体与菌株
1.3 二化螟幼虫
1.4 miRNA抗虫转基因水稻csu-15
2 试验方法
2.1 二化螟总RNA的抽提及反转录
2.2 候选靶标片段的选择
2.3 干涉载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
2.4 转化植株的T0代阳性检测
2.5 利用Southern blotting对转化植株进行拷贝数检测
2.5.1 植物基因组大量样品抽提
2.5.2 基因组DNA的检测
2.5.3 酶切和虹吸法转膜印记
2.5.4 预杂交
2.5.5 标探针、加探针
2.5.6 洗膜及压磷屏显像
2.6 转化植株的表达量检测
2.7 体外dsRNA的人工合成
2.8 喂虫试验
2.8.1 人工饲料饲喂
2.8.2 室内幼苗饲喂
2.8.3 室内茎秆接虫
2.8.3.1 短期茎秆抗虫鉴定
2.8.3.2 二化螟全生育期连续喂食
2.9 喂食csu-15材料的二化螟中肠组织差异表达分析
2.9.1 二化螟中肠组织RNA分离及测序
2.9.2 差异表达分析
2.9.3 miRNA靶标预测
3 结果与分析
3.1 dsRNA的合成
3.2 dsRNA人工饲料饲喂试验结果
3.3 转化片段植株拷贝数检测及表达量检测
3.3.1 植株拷贝数检测
3.3.2 植株表达量检测
3.4 室内茎秆饲喂结果
3.5 csu-15二化螟抗性鉴定及喂食后二化螟中肠差异表达分析
3.5.1 csu-15转基因植株对二化螟的抗性鉴定
3.5.2 二化螟中肠差异表达分析
4 讨论
4.1 RNAi抗虫策略遇到的问题与解决思路
4.2 dsRNA抗虫与miRNA抗虫的比较
第四章 水稻全长cDNA PET文库构建及分析
1 试验材料
2 试验方法
2.1 RNA抽提
2.2 全长cDNA的获得与文库制备
2.3 测序
2.4 数据分析及评估
3 结果与分析
3.1 测序与TSS-PAS对提取结果
3.2 两个水稻数据库匹配结果
3.2.1 RAGP 7比对结果
3.2.2 KOME比对结果
3.2.3 可变的转录起始位点或转录终止位点
4 讨论
4.1 全长cDNA PET文库构建
4.2 利用RAPG 7与KOME数据库对本策略的评估
4.3 与三代测序全长转录组的比较
参考文献
附录1 全长cDNA文库构建过程中涉及的自定义序列
致谢
本文编号：3784347
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