樗蚕孵化酶基因的克隆与特性分析

发布时间：2023-04-10 20:13

　　樗蚕(Philosamia cynthia cynthia)又名椿蚕、小桕蚕等,属于鳞翅目大蚕蛾科、樗蚕蛾属的一个物种。樗蚕以蓖麻、乌桕、臭椿(樗)等作为食物,杂食性强、繁殖力强,是园林植物的重要害虫;樗蚕也是泌丝营茧的资源昆虫,茧可用于制丝,蚕蛹可以作为食品或饲料,是重要的经济昆虫。孵化酶(Hatching enzyme,HE)是由胚胎孵化腺细胞分泌的一种蛋白酶,通过降解卵膜/卵壳,使幼虫孵化,进而进行后期的生长发育。本文根据已报道鳞翅目昆虫孵化酶的基因保守序列,用RACE-PCR技术获得樗蚕孵化酶全长序列,对樗蚕孵化酶进行时空表达模式分析、组织表达模式分析、原核表达分析。本文主要获得如下研究结果:(1)利用RACE-PCR和RT-PCR首次获得樗蚕孵化酶的全长cDNA。樗蚕孵化酶基因由5’非翻译区、3’非翻译区和885 bp的开放阅读框组成,全长964 bp,且3’UTR含有一个多聚腺苷酸AATAAA信号。同源序列比对结果表明,樗蚕与蓖麻蚕、野蚕、柞蚕、家蚕、桑蟥、小菜蛾、果蝇和蚊子等昆虫聚类,其中,樗蚕孵化酶与蓖麻蚕孵化酶之间的亲缘关系最近。(2)用软件对PccHE蛋白的三级结构...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 概述
    1.2 动物孵化酶研究进展
        1.2.1 虾红素蛋白酶家族
        1.2.2 鱼类孵化酶的研究进展
        1.2.3 哺乳动物孵化酶的研究进展
        1.2.4 昆虫孵化酶的研究进展
        1.2.5 其他动物孵化酶的研究进展
    1.3 部分野蚕基因克隆研究进展
        1.3.1 野桑蚕
        1.3.2 柞蚕
        1.3.3 蓖麻蚕
        1.3.4 柳蚕
        1.3.5 其他野蚕
    1.4 本课题的研究目的与意义
    1.5 本文主要研究内容及关键技术
        1.5.1 主要内容
        1.5.2 关键技术
        1.5.3 技术路线
第二章 樗蚕孵化酶基因全长cDNA的克隆与时空表达分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 宿主菌、载体、酶
        2.1.2 主要实验仪器和设备
        2.1.3 常用试剂和缓冲液
        2.1.4 PccHE部分序列的基因克隆
        2.1.5 引物设计
        2.1.6 总RNA提取
        2.1.7 PccHE第一链cDNA合成
        2.1.8 PccHE部分片段的克隆
        2.1.9 胶回收试剂盒回收DNA
        2.1.10 目的片段与pMD18-T载体的连接
        2.1.11 感受态细胞制备
        2.1.12 转化
        2.1.13 碱裂解法少量提取质粒DNA
        2.1.14 甘油菌的制备及序列测定
        2.1.15 3'RACE扩增PccHE基因3'端序列
        2.1.16 Clontech 5'RACE扩增PccHE 5'端序列
        2.1.17 PccHE表达模式分析
        2.1.18 生物信息学分析
        2.1.19 PccHE ORF序列的克隆
    2.2 结果
        2.2.1 樗蚕孵化酶基因PccHEc DNA部分序列的克隆
        2.2.2 PccHE全长的克隆
        2.2.3 同源比对及进化分析
        2.2.4 樗蚕孵化酶三级结构
        2.2.5 卵催青期胚胎发育不同阶段PccHE转录水平的变化
        2.2.6 幼虫期PccHE组织表达谱
    2.3 讨论
    2.4 本章小结
第三章 PccHE的原核表达分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 去信号肽序列与成熟酶序列对应核苷酸序列的克隆
        3.1.3 原核表达重组载体的构建
        3.1.4 PccHE蛋白的原核表达
        3.1.5 SDS-PAGE电泳
        3.1.6 Western Blot
    3.2 结果
        3.2.1 原核表达重组载体的构建
        3.2.2 重组载体的原核表达
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3788658