DRB4在抗病毒RNAi中的作用机理及番茄中的抗病毒RNAi
发布时间：2023-04-11 02:33
抗病毒RNAi是一类广泛而且保守的表观遗传学调控过程,近似于RNAi介导的基因沉默。病毒侵染后,复制中产生的双链RNA(ds RNAs)被Dicer蛋白识别并切割成长度为21-30 nt的si RNA,si RNA与AGO形成RISC复合体诱导病毒RNA的降解或翻译。拟南芥共编码4种DCL蛋白和5种DRB蛋白。其中,DCL4切割产生的21 nt的si RNA在抗病毒免疫中起主要作用。DCL4与双链RNA(ds RNA)结合蛋白(ds RBP)DRB4的特异性相互作用在植物内源si RNA的产生中起关键作用,然而,DRB4在抗病毒过程中的具体功能还未知。本研究通过CRISPR/CAS9基因编辑技术获得drb4突变体,接种病毒后发现,病毒含量在drb4突变体中并未明显增加,可能其它DRB存在重复功能。然而,我们研究发现DRB4与实验室新发现的抗病毒调控因子GLTP1和LPEAT1相互作用。此外,我们发现,在抗病毒RNAi缺陷的ala1/ala2突变体,DRB4-YFP融合蛋白的定位发生明显变化。本研究结果为揭示DRB4在抗病毒RNAi中的具体功能奠定了一定基础。番茄是一种重要的经济蔬菜作物...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1.1 RNAi介导的抗病毒免疫机制
1.1.1 RNAi
1.1.2 植物中RNAi介导的抗病毒免疫途径
1.2 双链RNA结合蛋白4(DRB4)的研究进展
1.2.1 双链RNA结合蛋白DRB4
1.2.3 植物中DRB4的抗病毒功能研究
1.3 番茄中RNAi介导的抗病毒研究进展
1.4 黄瓜花叶病毒的研究进展
1.4.1 黄瓜花叶病毒的发生及分布
1.4.2 黄瓜花叶病毒的基因组结构及其功能
1.4.3 基于CMV-Δ2b的抗病毒基因筛选系统
1.4.4 黄瓜花叶病毒的症状与检测
1.4.5 黄瓜花叶病毒的防治
1.5 技术体系简介
1.5.1 农杆菌介导的番茄遗传转化体系
1.5.2 Nothern Blot印迹杂交
1.5.3 双分子荧光互补BiFC
1.6 立题依据及意义
第二章 DRB4 在抗病毒RNAi中的作用机理
2.1 试验材料
2.2 试验试剂
2.3 培养基及抗生素配制
2.4 试验方法
2.4.1 构建CRISPR/CAS9 双元表达载体
2.4.2 构建DRB4亚细胞定位表达载体
2.4.3 构建BiFC表达载体
2.4.4 农杆菌GV3101感受态的制备
2.4.5 农杆菌GV3101感受态的转化
2.4.6 农杆菌介导的野生型拟南芥Col转基因及遗传筛选
2.4.7 CTAB法提取drb4 突变体DNA及 PCR鉴定
2.4.8 Fny-CMV及 VSR突变体病毒摩擦接种拟南芥
2.4.9 Trizol法提取植物总RNA
2.4.10 Northern Blot检测CMV-mRNA积累量
2.4.11 Northern Blot检测病毒siRNA积累量
2.4.12 本氏烟中瞬时表达DRB4蛋白
2.5 结果与分析
2.5.1 DRB4 的抗病毒RNAi功能分析
2.5.2 DRB4的亚细胞定位分析
2.5.3 BiFC检测DRB4 与其他抗病毒因子的互作
2.6 小结与讨论
第三章 番茄中抗病毒RNAi的初步研究
3.1 试验材料
3.2 试验试剂
3.3 试验方法
3.3.1 Fny-CMV及 VSR突变体病毒摩擦接种番茄
3.3.2 Western Blot检测CMV-CP蛋白的积累量
3.3.3 Northern Blot检测CMV-mRNA的积累量
3.3.4 构建CRISPR/CAS9 双元表达载体
3.3.5 番茄遗传转化体系
3.4 结果与分析
3.4.1 CMV对番茄的侵染性分析
3.4.2 CRISPR敲除番茄DCLs、AGOs及 RDRs基因
3.5 小结与讨论
第四章 总结
参考文献
附录 引物
致谢
本文编号：3789164
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摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1.1 RNAi介导的抗病毒免疫机制
1.1.1 RNAi
1.1.2 植物中RNAi介导的抗病毒免疫途径
1.2 双链RNA结合蛋白4(DRB4)的研究进展
1.2.1 双链RNA结合蛋白DRB4
1.2.3 植物中DRB4的抗病毒功能研究
1.3 番茄中RNAi介导的抗病毒研究进展
1.4 黄瓜花叶病毒的研究进展
1.4.1 黄瓜花叶病毒的发生及分布
1.4.2 黄瓜花叶病毒的基因组结构及其功能
1.4.3 基于CMV-Δ2b的抗病毒基因筛选系统
1.4.4 黄瓜花叶病毒的症状与检测
1.4.5 黄瓜花叶病毒的防治
1.5 技术体系简介
1.5.1 农杆菌介导的番茄遗传转化体系
1.5.2 Nothern Blot印迹杂交
1.5.3 双分子荧光互补BiFC
1.6 立题依据及意义
第二章 DRB4 在抗病毒RNAi中的作用机理
2.1 试验材料
2.2 试验试剂
2.3 培养基及抗生素配制
2.4 试验方法
2.4.1 构建CRISPR/CAS9 双元表达载体
2.4.2 构建DRB4亚细胞定位表达载体
2.4.3 构建BiFC表达载体
2.4.4 农杆菌GV3101感受态的制备
2.4.5 农杆菌GV3101感受态的转化
2.4.6 农杆菌介导的野生型拟南芥Col转基因及遗传筛选
2.4.7 CTAB法提取drb4 突变体DNA及 PCR鉴定
2.4.8 Fny-CMV及 VSR突变体病毒摩擦接种拟南芥
2.4.9 Trizol法提取植物总RNA
2.4.10 Northern Blot检测CMV-mRNA积累量
2.4.11 Northern Blot检测病毒siRNA积累量
2.4.12 本氏烟中瞬时表达DRB4蛋白
2.5 结果与分析
2.5.1 DRB4 的抗病毒RNAi功能分析
2.5.2 DRB4的亚细胞定位分析
2.5.3 BiFC检测DRB4 与其他抗病毒因子的互作
2.6 小结与讨论
第三章 番茄中抗病毒RNAi的初步研究
3.1 试验材料
3.2 试验试剂
3.3 试验方法
3.3.1 Fny-CMV及 VSR突变体病毒摩擦接种番茄
3.3.2 Western Blot检测CMV-CP蛋白的积累量
3.3.3 Northern Blot检测CMV-mRNA的积累量
3.3.4 构建CRISPR/CAS9 双元表达载体
3.3.5 番茄遗传转化体系
3.4 结果与分析
3.4.1 CMV对番茄的侵染性分析
3.4.2 CRISPR敲除番茄DCLs、AGOs及 RDRs基因
3.5 小结与讨论
第四章 总结
参考文献
附录 引物
致谢
本文编号：3789164
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