黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及RDV感染对其转录水平的影响
发布时间：2023-04-11 23:03
黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps(Uhler)属于半翅目叶蝉科,是我国水稻上重要害虫之一。黑尾叶蝉除刺吸取食水稻汁液为害外,还能传播水稻矮缩病毒(rice dwarf virus,RDV),对水稻造成了严重危害。昆虫先天免疫是昆虫防御病原微生物的首道防线,而肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)则是昆虫免疫系统中的重要免疫识别蛋白,在昆虫产生抗菌肽等免疫物质的过程中起到重要调控作用。黑尾叶蝉作为RDV的介体昆虫,目前关于RDV对黑尾叶蝉免疫能力影响的相关报道较少。本文通过转录组分析,得到数个黑尾叶蝉PGRPs基因,筛选出其中转录水平被RDV所抑制的PGRPs,通过基因克隆及原核表达研究NcPGRP分子特性和蛋白特性,利用定量PCR和RNAi技术研究NcPGRP在黑尾叶蝉免疫反应中的功能。主要研究内容如下:1.以各常见昆虫PGRP基因作为参考序列,通过本地blast从黑尾叶蝉转录组数据中筛选到12个E值(E-Value)较高的PGRPs基因。利用定量PCR检测感染RDV黑尾叶蝉体内各PGRPs的表达量,筛选出3个...
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 文献综述
1.1 昆虫先天免疫
1.1.1 细胞免疫
1.1.2 体液免疫
1.2 肽聚糖识别蛋白在昆虫免疫中的作用
1.2.1 PGRP的结构特点
1.2.2 PGRP的功能
1.3 肽聚糖识别蛋白对黑尾叶蝉与RDV互作关系的影响
1.3.1 水稻普通矮缩病毒与黑尾叶蝉
1.3.2 黑尾叶蝉对水稻矮缩病毒的传播和获取
1.3.3 昆虫肽聚糖识别蛋白与病毒的互作关系
1.4 研究目的及意义
第二章 黑尾叶蝉PGRP基因注释及与RDV互作相关PGRP筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 供试昆虫与水稻
2.1.2 主要实验试剂与仪器
2.1.3 常见昆虫PGRP基因组数据收集
2.1.4 本地Blast的基本操作过程
2.1.5 总RNA提取及cDNA第一链合成
2.1.6 取样
2.1.7 荧光定量PCR检测表达水平
2.1.8 数据分析
2.2 结果与分析
2.2.1 黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白基因筛选结果
2.2.2 RDV感染对黑尾叶蝉PGRPs转录水平的影响
2.3 讨论
第三章 黑尾叶蝉NcPGRP基因的克隆与组织分布分析
3.1 材料与方法
3.1.1 供试昆虫与水稻
3.1.2 主要实验试剂与仪器
3.1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成
3.1.4 琼脂糖凝胶电泳
3.1.5 分子克隆
3.1.6 黑尾叶蝉NcPGRP基因的生物学分析
3.1.7 黑尾叶蝉各组织NcPGRP基因转录水平分析
3.1.8 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 黑尾叶蝉NcPGRP基因的克隆验证与序列分析
3.2.2 黑尾叶蝉NcPGRP基因的多序列比对及进化分析
3.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因组织分布分析
3.3 讨论
第四章 黑尾叶蝉NcPGRP的原核表达、抗体制备及Western Blot
4.1 材料与方法
4.1.1 供试昆虫与水稻
4.1.2 主要试剂盒实验仪器
4.1.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因重组表达质粒构建
4.1.4 重组质粒的诱导表达
4.1.5 重组蛋白的SDS-PAGE检测
4.1.6 重组蛋白的western blot验证
4.1.7 重组蛋白纯化
4.1.8 纯化蛋白的透析
4.1.9 纯化蛋白浓度测定
4.1.10 Western Blot验证抗体效果
4.1.11 取样
4.1.12 SDS-PAGE
4.1.13 Western Blot
4.2 结果与分析
4.2.1 黑尾叶蝉NcPGRP蛋白原核表达
4.2.2 黑尾叶蝉NcPGRP原核表达蛋白纯化
4.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP蛋白的western blot分析
4.3 讨论
第五章 黑尾叶蝉NcPGRP基因的免疫刺激及RNA干扰
5.1 材料与方法
5.1.1 供试昆虫与水稻
5.1.2 实验试剂与仪器
5.1.3 大肠杆菌E.DH5α 和藤黄微球菌M.luteus的培养和活化
5.1.4病原细菌的显微注射
5.1.5 总RNA的提取及cDNA第一链合成
5.1.6 黑尾叶蝉NcPGRP基因免疫刺激后转录水平的定量分析
5.1.7 dsRNA合成
5.1.8 dsRNA的注射
5.1.9 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 RDV对黑尾叶蝉NcPGRP基因的抑制作用
5.2.2 病原细菌对NcPGRP基因的诱导结果分析
5.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因的RNA干扰条件筛选
5.2.4 病原细菌感染对RNA干扰后黑尾叶蝉死亡率的影响
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3789927
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 文献综述
1.1 昆虫先天免疫
1.1.1 细胞免疫
1.1.2 体液免疫
1.2 肽聚糖识别蛋白在昆虫免疫中的作用
1.2.1 PGRP的结构特点
1.2.2 PGRP的功能
1.3 肽聚糖识别蛋白对黑尾叶蝉与RDV互作关系的影响
1.3.1 水稻普通矮缩病毒与黑尾叶蝉
1.3.2 黑尾叶蝉对水稻矮缩病毒的传播和获取
1.3.3 昆虫肽聚糖识别蛋白与病毒的互作关系
1.4 研究目的及意义
第二章 黑尾叶蝉PGRP基因注释及与RDV互作相关PGRP筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 供试昆虫与水稻
2.1.2 主要实验试剂与仪器
2.1.3 常见昆虫PGRP基因组数据收集
2.1.4 本地Blast的基本操作过程
2.1.5 总RNA提取及cDNA第一链合成
2.1.6 取样
2.1.7 荧光定量PCR检测表达水平
2.1.8 数据分析
2.2 结果与分析
2.2.1 黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白基因筛选结果
2.2.2 RDV感染对黑尾叶蝉PGRPs转录水平的影响
2.3 讨论
第三章 黑尾叶蝉NcPGRP基因的克隆与组织分布分析
3.1 材料与方法
3.1.1 供试昆虫与水稻
3.1.2 主要实验试剂与仪器
3.1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成
3.1.4 琼脂糖凝胶电泳
3.1.5 分子克隆
3.1.6 黑尾叶蝉NcPGRP基因的生物学分析
3.1.7 黑尾叶蝉各组织NcPGRP基因转录水平分析
3.1.8 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 黑尾叶蝉NcPGRP基因的克隆验证与序列分析
3.2.2 黑尾叶蝉NcPGRP基因的多序列比对及进化分析
3.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因组织分布分析
3.3 讨论
第四章 黑尾叶蝉NcPGRP的原核表达、抗体制备及Western Blot
4.1 材料与方法
4.1.1 供试昆虫与水稻
4.1.2 主要试剂盒实验仪器
4.1.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因重组表达质粒构建
4.1.4 重组质粒的诱导表达
4.1.5 重组蛋白的SDS-PAGE检测
4.1.6 重组蛋白的western blot验证
4.1.7 重组蛋白纯化
4.1.8 纯化蛋白的透析
4.1.9 纯化蛋白浓度测定
4.1.10 Western Blot验证抗体效果
4.1.11 取样
4.1.12 SDS-PAGE
4.1.13 Western Blot
4.2 结果与分析
4.2.1 黑尾叶蝉NcPGRP蛋白原核表达
4.2.2 黑尾叶蝉NcPGRP原核表达蛋白纯化
4.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP蛋白的western blot分析
4.3 讨论
第五章 黑尾叶蝉NcPGRP基因的免疫刺激及RNA干扰
5.1 材料与方法
5.1.1 供试昆虫与水稻
5.1.2 实验试剂与仪器
5.1.3 大肠杆菌E.DH5α 和藤黄微球菌M.luteus的培养和活化
5.1.4病原细菌的显微注射
5.1.5 总RNA的提取及cDNA第一链合成
5.1.6 黑尾叶蝉NcPGRP基因免疫刺激后转录水平的定量分析
5.1.7 dsRNA合成
5.1.8 dsRNA的注射
5.1.9 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 RDV对黑尾叶蝉NcPGRP基因的抑制作用
5.2.2 病原细菌对NcPGRP基因的诱导结果分析
5.2.3 黑尾叶蝉NcPGRP基因的RNA干扰条件筛选
5.2.4 病原细菌感染对RNA干扰后黑尾叶蝉死亡率的影响
5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3789927
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