近暗散白蚁β-葡萄糖苷酶RpBgl7的异源表达及酶学性质研究

发布时间：2024-03-03 16:17

　　为研究近暗散白蚁(Reticulitermes perilucifugus)β-葡萄糖苷酶RpBgl7,利用生物信息学分析β-葡萄糖苷酶RpBgl7的家族及结构特点,构建RpBgl7的重组表达载体pCold-TF-RpBgl7,在大肠杆菌中过量表达并纯化,分析其最适反应条件和酶动力学参数。结果表明,RpBgl7属于糖苷水解酶1家族,具有2个保守的谷氨酸催化残基Glu187和Glu394。RpBgl7在BL21(DE3)中过量表达,经过镍离子亲和层析1步纯化可得到高纯度RpBgl7重组蛋白。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,测得RpBgl7的最适pH值为6.0,最适温度为70℃;动力学参数K_m=0.13 mmol/L,k_cat=3.15 s^-1。RpBgl7可耐受Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺,而Ca²⁺、Hg²⁺和Fe³⁺明显...

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【部分图文】：

图1RpBgl7与G1NKBG和Sfβgly的序列比对

RpBgl7具有494个氨基酸残基,分子质量为56.7ku,理论等电点pI=5,不稳定系数为38.4,表明RpBgl7较稳定,适合进行表达、纯化。RpBgl7与已解析结构的GH1家族β-葡萄糖苷酶G1NKBG(Uniprot:O61594,蛋白质数据库PDB:3ai0)、Sfβ....

图2RpBgl7蛋白的结构模型

图1RpBgl7与G1NKBG和Sfβgly的序列比对2.2重组载体pCold-TF-RpBgl7的构建

图3RpBgl7基因的扩增和重组载体的构建

质粒pCold-TF-RpBgl7所表达的RpBgl7重组蛋白的N端融合了触发因子(TF,分子质量为48ku),该因子作为分子伴侣,有助于重组蛋白的折叠;RpBgl7重组蛋白的N末端带有组氨酸(6×His)标签。RpBgl7蛋白经镍离子亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示100....

图4pCold-TF-RpBgl7表达载体结构

图3RpBgl7基因的扩增和重组载体的构建图5RpBgl7的纯化分析

本文编号：3918043