烟草花叶病毒RNAi制剂的研制
发布时间：2025-03-18 04:01
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)病是蔬菜等作物上的重要病害,目前缺乏有效的防治措施,RNA干扰(RNAi)技术的出现为病毒病害防治提供了新思路。研究表明,基于病毒基因的外源双链RNA(dsRNA)可以在植物体内诱导RNAi,但dsRNA易降解、作用时间有限,限制了这项技术的应用。本文以TMV衣壳蛋白(coat protein,CP)基因为目的片段,构建了TMV CP基因的原核表达载体,通过(E.coli)HT115(RNaseIII缺陷)菌株进行诱导表达得到dsRNA;同时体外合成dsRNA,并将合成的dsRNA分别与壳聚糖(Chitosan,CS)、层状双氢氧化物(layered double hydroxide,LDH)两种纳米材料进行融合,形成CS-dsRNA、LDH-dsRNA两种RNAi制剂,测试其稳定性结果表明:在4℃、25℃、37℃,30 d稳定性测定试验中,dsRNA的量较初始值分别减少了80.01%、58.89%和59.76%,降解比较明显,dsRNA在4℃的降解速率略高于在25℃和37℃的降解速率;CS-dsRNA制剂中dsRNA的量较...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1 烟草花叶病毒研究概况
1.1 烟草花叶病毒的发现
1.2 烟草花叶病毒粒子形态和基因组结构
1.3 烟草花叶病毒病的研究进展
1.4 烟草花叶病毒病的防治
2 纳米材料的简介
2.1 纳米材料的定义
2.2 纳米材料的分类
2.3 纳米材料对植物生长发育的影响
2.3.1 纳米材料对植物生长发育的促进作用
2.3.2 纳米材料对植物生长发育的抑制作用
2.4 纳米材料在分子生物学方面的研究应用
3 RNAi研究进展概述
3.1 RNAi的简介
3.2 RNAi的作用机制
3.3 RNAi的特点
3.4 RNAi技术在防治植物病毒病方面的应用
3.4.1 病毒基因体外转录的dsRNA诱导植物产生RNAi
3.4.2 转入病毒病原dsRNA表达载体的转基因植物
3.4.3 体外合成的dsRNA转入靶标植物诱导产生RNAi
4 研究的目的和意义
第二章 TMV CP基因原核表达载体的构建和dsRNA的诱导表达
1 材料
1.1 菌株与载体
1.2 酶与试剂
1.3 仪器与设备
1.4 引物
2 常规DNA分子操作技术
2.1 RNA的提取
2.1.1 硅粒吸附法提取病毒RNA
2.1.2 Trizol法提取植物RNA
2.2 cDNA的合成
2.3 PCR反应
2.4 电泳
2.5 DNA的纯化回收
2.5.1 PCR产物纯化回收试剂盒
2.5.2 DNA的割胶回收试剂盒
2.6 DNA的连接
2.7 连接产物转化大肠杆菌
2.8 转化后对重组子阳性情况的筛选与鉴定
2.8.1 菌落PCR筛选阳性重组子
2.8.2 质粒提取(碱裂解法)
2.8.3 质粒提取(试剂盒)
2.8.4 质粒的纯化与浓缩
2.9 重组质粒酶切鉴定
2.10 重组质粒测序鉴定
3 pLitmus28i原核表达载体的构建
3.1 酶切pLitmus28i载体
3.2 酶切目的片段
3.3 酶切产物的回收
3.4 28i载体与目的片段连接转化
3.5 感受态细胞的制备方法
3.6 目的片段转入大肠杆菌HT115
3.7 质粒的提取
3.8 重组质粒的PCR鉴定
3.9 重组质粒酶切鉴定
3.10 电泳检测
3.11 重组质粒测序鉴定
4 dsRNA的诱导表达
4.1 dsRNA的诱导
4.2 CTAB法提取dsRNA
4.3 Trizol法提取dsRNA
5 结果与分析
5.1 TMV-CP-T载体的构建及表达
5.2 TMV-CP-28i载体的构建及表达
5.3 TMV-CP基因诱导表达dsRNA
6 结论与讨论
第三章 体外合成的TMV CP基因dsRNA与纳米材料的融合
1 材料
1.1 供试材料
1.2 酶与试剂
1.3 仪器与设备
1.4 引物
1.5 数据统计与分析
2 试验方法
2.1 体外转录合成dsRNA
2.1.1 模板的制备
2.1.2 体外合成dsRNA
2.2 纳米材料-ds RNA的合成
2.2.1 CS-dsRNA的融合[40]
2.2.2 LDH-dsRNA的融合
2.3 纳米材料-RNAi制剂稳定性测定
3 结果与分析
3.1 体外合成dsRNA
3.2 纳米材料-ds RNA制剂的研制
3.3 纳米材料-ds RNA制剂吸附稳定性的测定
3.4 结论与讨论
第四章 RNAi制剂对TMV的预防和治疗试验
1 材料
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
1.1.2 供试纳米材料-RNAi制剂
1.1.3 供试植物
1.1.4 供试制剂
1.2 试剂
1.3 数据统计与分析
2 试验方法
2.1 纳米材料-ds RNA制剂对烟草花叶病毒的预防和治疗试验
2.1.1 预防试验
2.1.2 治疗试验
3 试验结果
4 结论与讨论
第五章 全文主要结论及创新点
1 全文主要结论
2 全文主要创新点
参考文献
致谢
作者简介
附录1 本试验所用重要缩写词及中文对照
附录2 本试验所用溶液及培养基的配方
附录3 常用生化试剂及仪器
本文编号：4035973
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1 烟草花叶病毒研究概况
1.1 烟草花叶病毒的发现
1.2 烟草花叶病毒粒子形态和基因组结构
1.3 烟草花叶病毒病的研究进展
1.4 烟草花叶病毒病的防治
2 纳米材料的简介
2.1 纳米材料的定义
2.2 纳米材料的分类
2.3 纳米材料对植物生长发育的影响
2.3.1 纳米材料对植物生长发育的促进作用
2.3.2 纳米材料对植物生长发育的抑制作用
2.4 纳米材料在分子生物学方面的研究应用
3 RNAi研究进展概述
3.1 RNAi的简介
3.2 RNAi的作用机制
3.3 RNAi的特点
3.4 RNAi技术在防治植物病毒病方面的应用
3.4.1 病毒基因体外转录的dsRNA诱导植物产生RNAi
3.4.2 转入病毒病原dsRNA表达载体的转基因植物
3.4.3 体外合成的dsRNA转入靶标植物诱导产生RNAi
4 研究的目的和意义
第二章 TMV CP基因原核表达载体的构建和dsRNA的诱导表达
1 材料
1.1 菌株与载体
1.2 酶与试剂
1.3 仪器与设备
1.4 引物
2 常规DNA分子操作技术
2.1 RNA的提取
2.1.1 硅粒吸附法提取病毒RNA
2.1.2 Trizol法提取植物RNA
2.2 cDNA的合成
2.3 PCR反应
2.4 电泳
2.5 DNA的纯化回收
2.5.1 PCR产物纯化回收试剂盒
2.5.2 DNA的割胶回收试剂盒
2.6 DNA的连接
2.7 连接产物转化大肠杆菌
2.8 转化后对重组子阳性情况的筛选与鉴定
2.8.1 菌落PCR筛选阳性重组子
2.8.2 质粒提取(碱裂解法)
2.8.3 质粒提取(试剂盒)
2.8.4 质粒的纯化与浓缩
2.9 重组质粒酶切鉴定
2.10 重组质粒测序鉴定
3 pLitmus28i原核表达载体的构建
3.1 酶切pLitmus28i载体
3.2 酶切目的片段
3.3 酶切产物的回收
3.4 28i载体与目的片段连接转化
3.5 感受态细胞的制备方法
3.6 目的片段转入大肠杆菌HT115
3.7 质粒的提取
3.8 重组质粒的PCR鉴定
3.9 重组质粒酶切鉴定
3.10 电泳检测
3.11 重组质粒测序鉴定
4 dsRNA的诱导表达
4.1 dsRNA的诱导
4.2 CTAB法提取dsRNA
4.3 Trizol法提取dsRNA
5 结果与分析
5.1 TMV-CP-T载体的构建及表达
5.2 TMV-CP-28i载体的构建及表达
5.3 TMV-CP基因诱导表达dsRNA
6 结论与讨论
第三章 体外合成的TMV CP基因dsRNA与纳米材料的融合
1 材料
1.1 供试材料
1.2 酶与试剂
1.3 仪器与设备
1.4 引物
1.5 数据统计与分析
2 试验方法
2.1 体外转录合成dsRNA
2.1.1 模板的制备
2.1.2 体外合成dsRNA
2.2 纳米材料-ds RNA的合成
2.2.1 CS-dsRNA的融合[40]
2.2.2 LDH-dsRNA的融合
2.3 纳米材料-RNAi制剂稳定性测定
3 结果与分析
3.1 体外合成dsRNA
3.2 纳米材料-ds RNA制剂的研制
3.3 纳米材料-ds RNA制剂吸附稳定性的测定
3.4 结论与讨论
第四章 RNAi制剂对TMV的预防和治疗试验
1 材料
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
1.1.2 供试纳米材料-RNAi制剂
1.1.3 供试植物
1.1.4 供试制剂
1.2 试剂
1.3 数据统计与分析
2 试验方法
2.1 纳米材料-ds RNA制剂对烟草花叶病毒的预防和治疗试验
2.1.1 预防试验
2.1.2 治疗试验
3 试验结果
4 结论与讨论
第五章 全文主要结论及创新点
1 全文主要结论
2 全文主要创新点
参考文献
致谢
作者简介
附录1 本试验所用重要缩写词及中文对照
附录2 本试验所用溶液及培养基的配方
附录3 常用生化试剂及仪器
本文编号：4035973
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/4035973.html
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