南方红豆杉细胞悬浮培养体系建立及培养条件优化

发布时间：2020-04-09 05:36

【摘要】：本试验以南方红豆杉一年生枝条诱导愈伤组织,建立细胞悬浮培养体系;分析悬浮细胞生长、紫杉醇积累动力学关系及主要营养成分的变化;同时探讨了理化因子对悬浮细胞生长及紫杉醇含量的影响。主要研究结果如下:1.从消毒组合、植物生长调节剂浓度与配比等因素,设计了外植体消毒方案及愈伤组织诱导方法;通过单因素和正交试验,筛选和优化南方红豆杉细胞悬浮培养的培养基种类、细胞接种量、培养基初始pH、植物生长调节剂种类及配比等,建立南方红豆杉细胞悬浮培养体系。结果表明,最适的消毒方式为75%酒精浸泡0.5 min后,再用0.1%氯化汞浸泡8 min;愈伤组织诱导固体培养基以MS+1.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+1.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖为最佳。适合南方红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基配方为:B5+0.4 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA+1.2 mg/L 6-KT+30 g/L蔗糖,细胞最佳接种量为0.09 g/mL,初始pH为5.8;在27 d的培养周期内,悬浮培养的南方红豆杉细胞的生长曲线呈“S”型,第15 d时细胞鲜重达到最大值,为7.66 g/(30 mL)。2.采用超声波提取法从南方红豆杉愈伤组织中提取紫杉醇,通过单因素和正交实验考察了溶剂、级数、温度、时间、料液比对南方红豆杉细胞愈伤组织中紫杉醇提取的影响。结果表明,南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇的最佳提取条件是:溶剂为甲醇,提取3次,温度55℃、每次提取30 min、料液比1:40。3.研究了南方红豆杉悬浮培养过程中细胞生长和紫杉醇积累的动力学关系及主要营养成分的变化,建立动力学模型。结果表明,在27 d的培养周期内,培养液中的总糖、磷元素、铵态氮、硝态氮在细胞培养的第18 d基本被消耗完;动力学拟合表明,南方红豆杉悬浮培养细胞生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率为0.14365 d~(-1),底物消耗和紫杉醇合成可用Luedeking-Piret模型描述,悬浮细胞生长与紫杉醇积累属于部分生长偶联型。4.研究了碳源、氮源、磷源、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度对南方红豆杉悬浮培养细胞生长及紫杉醇合成的影响。结果表明,蔗糖浓度为30 g/L时,细胞生长较好,其浓度为40 g/L时,有利于紫杉醇的合成;铵态氮与硝态氮比例为3:24时,有利于细胞生长和紫杉醇合成;总氮浓度较高时有利于细胞生长,而低溶度氮有利于紫杉醇合成;磷源浓度为1 mmol/L时有利于细胞生长,磷源浓度为0.25 mmol/L时有利于紫杉醇的合成;CaCl_2浓度为2 mmol/L有利于细胞生长和紫杉醇合成;MgSO_4浓度为3 mmol/L时最有利于细胞生长,MgSO_4浓度为2 mmol/L时有利于紫杉醇合成。
【图文】：

南方红豆杉,红豆杉

全世界大约有 11 个种和于美国和加拿大；欧洲大部分红豆杉品种主要有南方红豆杉南红豆杉(Taxus yunnanensis)nensis）、神龙架红豆杉[2]；欧主要有佛罗里达红豆杉(Taxu杉 1 变种，自然分布于亚热带杉野生资源分布较多的省份有长 4-5 mm，被红色肉质杯状假个冬季和一个夏季才会开始发毛、须根等结构组成；主根不养分和水分[4]。，紫杉醇含量虽稍低与喜马拉巨大的药用开发与利用价值[5, 6]

紫杉醇

图 1-2 紫杉醇Fig.1-2 Paclitaxel家Christon和Gibson初次发表了利用细胞培养来的首个专利[14]；l991年，我国学者朱蔚华教授FDA允许紫杉醇在临床中使用。这些研究与发生产紫杉醇研究在全球得到快速发展。美国、国家的制药企业和科学研究者都在开展广泛的动力学、代谢调控、生物反应器扩大培养和紫养研究进展植物离体培养，，是指从植物体分离出组织、器适的培养基上培养以获取再生的完整植株或获纪初提出的。最先哈勃兰德(Haberlandt)于190次利用人工培养基对植物细胞进行分离培养。在全能性。Gautheret和White等于1939年第一次
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S791.49

【参考文献】