皱叶膏桐成花相关基因的克隆及分析

发布时间：2020-04-16 21:11

【摘要】：膏桐(Jatropha carcas L.)为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)植物,是重要的能源树种,雌花少,雌雄花比例低(1:20)影响产量。皱叶膏桐(Jatropha nigroviensrugosus CV Yang)是新发现的变种,具有生殖优势,雌雄花比例较高(1:8),进行皱叶膏桐成花相关基因的克隆及分析可以探究皱叶膏桐生殖优势存在的原因。本研究利用Illusima测序技术针对两膏桐进行比较转录组学分析,获取差异表达目的基因全长,RT-qPCR技术进行目的基因不同组织部位的时空间表达分析,利用亚细胞功能定位,双分子荧光互补,转基因功能验证等了解基因的具体功能,为膏桐分子育种与栽培生殖调控提供指导。结果表明:(1)转录组文库测序质量良好,Q20在97%以上,Q30在93%以上,QC平均含量在43.5%。皱叶膏桐和膏桐与基因组比对率均在96%以上,序列差异小,亲缘关系接近。GO富集结果显示,两膏桐叶芽对光响应上存在着显著差异;基因表达趋势发现,9条基因只在两膏桐雄花中高表达,雌、雄花中均上调表达的基因,多数为花器官形成相关基因;两膏桐的花序芽部位被明显聚类区分,差异基因达1646条。植物激素信号传导途径参与了膏桐的性别分化和花芽形成的过程,而DELLA、MYC2、CYCD3等基因可能与皱叶膏桐花序芽形成过程中雄花原基的败育等过程以及雌花性别的决定相关。(2)对皱叶膏桐组内差异基因富集显示,与蔗糖磷酸合成酶,可溶性淀粉合成酶(EC:2.4.1.21)和颗粒结合淀粉合成酶(EC:2.4.1.242)有关的基因的高表达可能促进了雄花的形成和发育,基因CUC2和CUC3可能调节雌花的形成和发育。花器官发育的特征基因在四个组织部位中保守表达,高表达的均为II型MADS-box基因。(3)共获得3条差异基因的全长。皱叶膏桐JnCYCD3;1开放阅读框(ORF)长414bp,编码137aa,与膏桐相比,存在内含子的保留导致编码框的提前终止,RT-qPCR表明JnCYCD3;1在新生叶的部位的表达最高,是根部表达的68.42倍,其次是花序芽,花序芽与雌花形成早期的表达量无差异,在花粉形成时期的表达量最低。皱叶膏桐JnSLR1的ORF长1641bp,编码546 aa,JnSLR1在花序芽的部位的表达最高,其次是新叶,在皱叶膏桐雌、雄花之中的表达量并无差异。皱叶膏桐JnMYC2 ORF 2025bp,编码674 aa,JnMYC2在花序芽的部位的表达最高,在皱叶膏桐新叶,雌、雄花之间的表达量并无差异。(4)启动子元件分析表明,pJnCYCD3;1具备JA反应元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、分生组织表达相关元件(CAT-box)、MYB结合位点参与类黄酮生物合成基因调控(MBSI)、光反应元件(GT1-motif、AAAC-motif)等;pJnSLR1中存在赤霉素响应元件TATC-box,MYB、MYC调控原件,光调控元件(Box II、Box 4、GT1-motif等)、胁迫响应元件等;pJnMYC2基因启动子中存在CAT-box(与分生组织表达有关的顺式作用元件),较多的光调控元件(GT1-motif、G-box、MRE等)、胁迫响应元件等。(5)亚细胞功能定位实验表明,JnCYCD3;1、JnSLR1均在细胞核中发挥功能;JnMYC2可能具备跨核膜行为。(6)双分子荧光互补实验表明,JnMYC2与JnCYCD3;1存在互作。(7)JnCYCD3;1转基因烟草能够明显的提前生殖周期,可能具有促进花形成和转变的作用。
【图文】：

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文产量高（杨成源等，2015）。对皱叶膏桐的引种试验和多年的物候观察与统计，发现皱叶膏桐除明显的叶表型差异外（图 1-1），两膏桐开花物候相近，膏桐较皱叶膏桐花期提前一周左右；皱叶膏桐雌雄花比最高可为 1:8，平均为 1:17；而膏桐的最高雌雄比只达 1:20，，平均雌雄比仅为 1:35。对皱叶膏桐的生殖优势发生时期和发生机理尚无研究报道明确指出（何花. 2016），膏桐雌、雄花性别分化的决定机制也尚未阐明。

图 1-2 拟南芥开花时间基因网络（Bluemel et al., 2015）Fig1-2. Flowering time gene network of Arabidopsis thaliana (Bluemel et al., 2015)目前在拟南芥中共鉴定出了 180 多个参与调控开花的基因，并确定光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径、温敏途径和年龄途径为调控开花的信号途径（Fornara et al., 2010）。而在膏桐成花研究相关中，光周期途径和赤霉素途径相关研究较多。在光周期途径中，CO，FT 等基因作为光周期的关键调控因子，发挥着重要的功能。在拟南芥和膏桐树种中过表达膏桐成花相关同源基因，具有不一样的功能作用强度，这有可能是物种间的差异所导致的。在对膏桐中的 CO 基因进行系统进化分析发现，膏桐的 CO 虽然也具有 B-box 和 CCT 元件，但是不属于任何双子叶植物或者单子叶植物植物进化枝，可能失去原有的功能，并不直接参与开花调控（Ohmido et al., 2017）。膏桐的 FT/TFL1 基因家族 6 个成员的表达具有
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S794.9

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本文编号：2630037